免疫試紙條技術(shù)改進(jìn)及高分辨熔解曲線應(yīng)用菌群分類的初步摸索.pdf

1、微生物的快速檢測和分類方法研究是應(yīng)用微生物領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。在微生物快速檢測領(lǐng)域,50％以上食品中毒事件歸因于食源性致病菌的感染,其快速檢測技術(shù)備受關(guān)注;在微生物菌群分類領(lǐng)域,變性梯度凝膠電泳及溫度梯度凝膠電泳技術(shù)日臻成熟,而高分辨熔解曲線技術(shù)的應(yīng)用鮮見報(bào)道。
　　免疫層析試紙條技術(shù)因其操作簡便、快速且價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于食品安全快速篩查領(lǐng)域,并逐步拓展到食源性致病菌的現(xiàn)場快速檢測及診斷。然而,傳統(tǒng)的致病菌試紙條檢測方法需制

2、備特異性好,親和力強(qiáng)的抗體,耗時(shí)耗力,且靈敏度不高。為此,本研究擬克羅諾桿菌和副溶血弧菌為檢測對象,從兩方面對其試紙條方法加以改進(jìn)。一方面利用核酸雜交技術(shù)代替抗原抗體反應(yīng)原理,制備了克羅諾桿菌核酸試紙條;另一方面,在傳統(tǒng)試紙條的基礎(chǔ)上,以副溶血弧菌為檢測對象,利用膠體金標(biāo)記的羊抗鼠二抗增強(qiáng)試紙條顯色,提高其檢測靈敏度。此外,為豐富微生物菌群分類的技術(shù)方法,本研究將高分辨熔解曲線技術(shù)初次應(yīng)用于微生物的菌群分類分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

3、,制備的克羅諾桿菌核酸試紙條在純培養(yǎng)物中的靈敏度為105 CFU/mL,在添加108 CFU/mL鼠傷寒沙門氏菌的奶粉樣品中的靈敏度為106 CFU/mL。同時(shí)制備的副溶血弧菌免疫層析試紙條,加樣5 min后,加入由膠體金標(biāo)記的羊抗鼠二抗,能將顯色強(qiáng)度提高5倍,在純培養(yǎng)物中試紙條的靈敏度為1×106 CFU/mL,在同時(shí)添加108 CFU/mL克羅諾桿菌、志賀氏菌的魚肉糜樣本中,檢測限為107 CFU/g。兩種試紙條都表現(xiàn)出良好的特異性

4、。
　　高分辨熔解曲線能夠區(qū)分單堿基差異的 DNA片段,在熔解曲線上表現(xiàn)為熔解溫度(Tm)的不同。本研究采用 PCR擴(kuò)增3號雙歧桿菌,通過添加尿素、甲酰胺和鹽酸胍等 DNA變性劑,發(fā)現(xiàn)尿素和甲酰胺能夠降低 Tm值,鹽酸胍升高 Tm值。通過擴(kuò)增小鼠腸道微生物的乳桿菌,加入不同濃度的 DNA變性劑,成功在熔解曲線上對菌群種類進(jìn)行了區(qū)分。
　　本文建立了用于克羅諾桿菌和副溶血弧菌快速檢測的試紙條方法,為其他食源性致病菌檢測提供了可