Genistein對乳腺癌骨轉移的防治作用與機理研究.pdf

1、研究背景
　　乳腺癌骨轉移患者由于轉移灶骨組織結構的破壞而出現(xiàn)劇烈骨痛、病理性骨折、高鈣血癥和神經(jīng)壓迫等癥狀,嚴重影響患者生存質量,但其確切機理尚不清楚。目前的研究多集中于探討乳腺癌細胞致破骨細胞(osteoclast,OC)活性的增加,但單純抑制OC活性并不能完全阻止溶骨性損傷的進展。近年有研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌細胞還可能影響到骨微環(huán)境中的其他細胞尤其是成骨細胞(osteoblast,OB)的生物學功能,刺激OB活性也可能是乳腺癌骨轉

2、移臨床干預的一個重要作用靶點。乳腺癌及其骨轉移的臨床處理頗為棘手,由于內(nèi)分泌治療存在副作用和耐藥性,有關選擇性雌激素受體調節(jié)劑(selectiveestrogenreceptormodulator,SERM)和雌激素天然替代品在乳腺癌輔助治療及預防骨轉移中的應用受到了廣泛關注。5,7,4'-三羥基異黃酮(genistein,又稱染料木黃酮或金雀異黃酮)是植物雌激素的重要活性成分,能與雌激素受體(estrogenreceptor,ER)結

3、合產(chǎn)生雌激素樣效應而無其副作用,有抗腫瘤、抗氧化、在正常骨組織代謝中促進骨形成并抑制骨吸收等作用,但在乳腺癌骨轉移等病理情況下是否也能調節(jié)骨代謝、緩解乳腺癌骨轉移所致的骨丟失,尚需深入研究。
　　研究目的
　　采用乳腺癌骨轉移裸鼠模型,預防或治療性給予Genistein進行干預,觀察其對裸鼠骨轉移灶形成和發(fā)展、骨量、骨組織結構、OB和OC生物學功能的影響。同時,采用體外培養(yǎng)成骨細胞,探討具備不同轉移特性的人乳腺癌細胞對成骨細

4、胞生物學功能的影響和作用靶點,以及Genistein對乳腺癌介質中生長的OB生物學功能影響的調控。從動物水平和細胞水平探討Genistein對乳腺癌骨轉移的防治作用及其相關機理,為改變臨床單純抑制OC活性的治療措施,緩解和預防乳腺癌骨轉移時發(fā)生的骨丟失提供理論依據(jù)和新的干預思路。
　　研究方法
　　采用左心室注射人源性乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞建立乳腺癌骨轉移裸鼠模型,預防或治療性給予Genistein進行干預。實

5、驗終點時行裸鼠活體x光顯像計數(shù)骨轉移灶數(shù)量并測量腫瘤體積,收集血標本后處死裸鼠,取骨標本行脫鈣和不脫鈣切片,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP)染色法觀察OC活性,Goldner-Trichrome三色法觀察并測量骨量和骨結構變化,自動生化分析儀測量血清鈣、磷和堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)水平,探討Genistein對裸鼠骨轉移灶的形成和發(fā)展,

6、以及乳腺癌骨轉移病理條件下對骨量和骨結構、OB和OC活性的影響作用。
　　同時,采用源于大鼠顱蓋骨的原代OB進行體外實驗,將OB與ER(-)的MDA-MB-231細胞或ER(+)的MCF-7細胞的條件培養(yǎng)基(conditionedmedium,CM)共同培養(yǎng),MTT法觀察條件培養(yǎng)基對OB增殖的影響,PNPP法觀察條件培養(yǎng)基對OB堿性磷酸酶活性的影響,茜素紅S(alizarinredS,ARS)進行礦化結節(jié)染色并計算面積觀察條件培養(yǎng)

7、基對OB礦化能力的影響,RT-PCR法分析條件培養(yǎng)基對OB骨相關基因BGP、OPG和RANKL表達水平的影響,以分析具備不同轉移特性的人乳腺癌細胞對OB生物學功能的可能影響作用和作用靶點。同時,在條件培養(yǎng)基體系中加入不同濃度的Genistein進行干預,進一步從細胞層面探討Genistein在乳腺癌骨轉移的病理條件下,對OB生物學功能的影響及可能作用機制。
　　結果
　　動物實驗結果顯示:左心室接種了MDA-MB-231乳腺

8、癌細胞后21天,裸鼠經(jīng)全身X線骨掃描顯示多個部位有溶骨性骨轉移灶形成,尤其多見于四肢。而預防性(接種乳腺癌細胞前7天或接種同時)給予Genistein進行干預,可不同程度地減少骨轉移灶數(shù)目和腫瘤體積,并減少TRAP染色陽性的OC數(shù)目,并可顯著增加骨小梁面積(Tb.Ar％)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁個數(shù)(Tb.N),減少骨小梁分離度(Tb.Sp),證明Genistein對乳腺癌骨轉移灶的形成和骨轉移所致的骨量丟失和骨結構破壞均有較

9、好的預防作用。即使在骨轉移灶形成后(接種后21天并經(jīng)全身X線骨掃描證實)治療性給予Genistein干預,仍能明顯減少骨轉移灶數(shù)目和腫瘤體積的增加,并減緩骨轉移所致的骨量丟失和骨結構損傷。同時,Genistein可部分逆轉乳腺癌骨轉移時的高ALP血癥,并對血鈣、血磷代謝失衡有一定修復作用。
　　體外實驗結果顯示:MDA-MB-231和MCF-7細胞的條件培養(yǎng)基均可使OB發(fā)生纖維細胞形態(tài)改變,表現(xiàn)為細胞突起和突起連接減少,并可明顯抑

10、制OB的增殖:與培養(yǎng)基對照組(vehiclemedium,VM)比較,加入50％來自MDA-MB-231或MCF-7細胞的CM后1d、3d、5d和7d,抑制率分別為18.1％、13.0％、19.2％、19.3％和15.8％、20.8％、33.9％、28.7％,且差異均有顯著意義(P＜0.01)。此外,CM可明顯下調OB的ALP活性,并呈劑量-效應關系,尤其是加入50％的CM后,對ALP活性的抑制作用分別達31.9％和47.5％(P＜0.

11、01)。CM對OB的礦化結節(jié)形成能力也有明顯抑制作用,隨著加入CM濃度的增加,形成的礦化結節(jié)面積明顯減少,尤其是加入50％MDA-MB-231或MCF-7的CM培養(yǎng)后,OB形成的礦化結節(jié)面積分別減少89％和74％(P＜0.01),即OB礦化結節(jié)形成能力幾乎被完全抑制。同時,乳腺癌細胞條件培養(yǎng)基可明顯下調骨相關基因BGP和OPG的表達,上調RANKL基因的表達。而采用5×10-7mol/L、5×10-8mol/L和5×10-9mol/L的

12、Genistein干預后,OB增值率和ALP活性較單純條件培養(yǎng)基組有不同程度的提高,OB的ALP活性分別較MDA-MB-231和MCF-7條件培養(yǎng)基對照組增加22.7％、32.4％、63.5％和27.7％、32.0％、58.3％(P＜0.05)。Genistein還可改善乳腺癌細胞條件培養(yǎng)基對OB礦化能力的抑制,增加OB形成的礦化結節(jié)面積,并上調:BGP、OPG基因表達,下調RANKL基因表達。
　　結論
　　Geniste

13、in可抑制溶骨性骨轉移灶的形成和發(fā)展,部分逆轉乳腺癌骨轉移所致的過度骨吸收、骨量丟失和骨結構損傷,對乳腺癌骨轉移的預防和治療均有一定作用。同時,具備不同轉移特性的人乳腺癌細胞均可抑制OB的增殖和礦化形成能力,下調ALP活性,即可能通過調節(jié)OB功能致骨形成減少。而Genistein可改善乳腺癌細胞對OB生物學功能的抑制作用,即可直接促進OB的增殖、分化和礦化能力,上調骨相關基因BGP和OPG的表達并下調RANKL基因的表達,可能是Geni