鹽酸戊乙奎醚對新生大鼠內毒素血癥時腸組織HIF-1α表達的影響.pdf

1、新生兒腸損傷是兒科常見的疾病之一，其發(fā)生的主要原因有早產、窒息引起的缺血缺氧以及感染等。其中嚴重感染常可導致危重患兒胃腸功能衰竭。腸道在全身炎癥反應綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著極其重要的角色。腸道感染或缺血缺氧會導致腸黏膜屏障功能受損，引起細菌及內毒素的移位，引發(fā)敗血癥和膿毒性休克，從而進一步加重腸組織的損傷，甚者可伴隨遠隔器官受累。脂多糖(LPS)作為典型的內毒素，可誘發(fā)內毒素血癥，導致腸

2、黏膜損害。國內外諸多研究發(fā)現缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在內毒素性腸損傷的病理改變過程中具有重要作用。有研究指出腸道缺血缺氧可以誘導腸黏膜HIF-1α持續(xù)高表達，這一結果至少在部分程度上是由于腸道細菌的移位及其產物（如LPS）的增加所造成的。HIF-1α能夠通過激活其下游的相關基因轉錄并促進炎癥因子的大量釋放和引起細胞凋亡等，從而加重內毒素血癥或缺血/再灌注時的組織損傷。鹽酸戊乙奎醚(PHC)是我國自主研制的抗膽堿藥。研究表明，鹽

3、酸戊乙奎醚因能改善微循環(huán)、降低毛細血管壁通透性和減少溶酶體釋放而具有多器官保護作用。目前鹽酸戊乙奎醚對內毒素性肺損傷的保護作用得到了廣泛地證實和認可，我們通過大量的臨床觀察發(fā)現鹽酸戊乙奎醚在解除腸痙攣、減輕腸道水腫方面同樣具有良好的效果。基于以上背景，本課題旨在研究內毒素致新生大鼠腸損傷時鹽酸戊乙奎醚預先給藥對腸組織HIF-1α表達的影響，并對其腸保護作用機制進行初步探討。
　　目的:
　　探討鹽酸戊乙奎醚預先給藥對內毒素致

4、新生大鼠腸損傷時腸組織HIF-1α和其他相關細胞因子表達的影響及其發(fā)揮腸保護作用的可能機制，為臨床防治新生兒腸損傷提供一條新的思路。
　　材料與方法:
　　1.研究對象
　　69只SPF級健康新生7日齡SD大鼠，由鄭州大學河南省實驗動物中心提供，雌雄不限，體重18±2g。
　　2.實驗方法
　　2.1、實驗動物分組
　　本實驗分為兩部分。第一部分:將30只幼鼠隨機分為3組，每組10只。分別為生理鹽水對

5、照組（C組）、內毒素致腸損傷模型組（L組）和鹽酸戊乙奎醚干預組（P組）。本部分實驗主要進行腸組織濕/干重比的測定、腸組織HE染色后光鏡下形態(tài)學改變的觀察以及相關細胞因子的檢測。第二部分:同樣將另39只健康新生7日齡SD大鼠隨機分為C組、L組和P組，每組13只。本部分實驗用于觀察造模后各組幼鼠行為活動的改變并計算每組24h生存率。
　　2.2、動物模型的制備
　　內毒素致腸損傷模型組腹腔注射內毒素（細菌脂多糖LPS，E.Col

6、i055:B5，Sigma公司，美國）5mg/kg，配制濃度為0.5mg/ml;鹽酸戊乙奎醚干預組在注射內毒素前30min，先腹腔注射鹽酸戊乙奎醚（成都力思特制藥股份有限公司，批號:120603）2mg/kg，配制濃度為0.05mg/ml;生理鹽水對照組腹腔注射生理鹽水10ml/kg。第一部分實驗于腹腔注射內毒素或生理鹽水后6h麻醉并解剖幼鼠。兩部分實驗均在造模完成后將幼鼠放回鼠籠與母鼠共同喂養(yǎng)。
　　2.3、腸組織的標本采集

7、r>　　在密閉玻璃容器中吸入七氟烷快速麻醉幼鼠后，將其固定于操作臺，解剖，用1ml注射器迅速進行心臟采血，靜置2小時，4℃下4000r/min離心15分鐘，取上清液，-20℃冰箱中保存待檢。距回盲部3cm向上取回腸組織7cm，4℃生理鹽水沖洗腸管3遍，濾紙吸干腸組織表面水分后，將7cm回腸組織分為4段:上段1cm用于光鏡下形態(tài)學觀察，中上段2cm用于測量腸組織濕重和干重，中下段2cm用于制備腸組織勻漿測定相關細胞因子的表達，下段2cm用

8、于RT-PCR檢測腸組織HIF-1αmRNA的表達。
　　2.4、檢測指標
　　2.4.1、計算腸組織濕/干重比(W/D)
　　電子稱重計稱量中上段2cm回腸組織并記錄濕重，隨后放入70℃恒溫烘干箱烘干48h至重量不再發(fā)生變化，測量干重，計算濕/干重比。
　　2.4.2、腸組織形態(tài)學觀察
　　將上段1cm回腸組織放入4％多聚甲醛中保存待檢。石蠟包埋后制作5μm病理切片，行HE染色。400倍光鏡下觀察回腸組織

9、黏膜上皮細胞形態(tài)學的改變。
　　2.4.3、ELISA法測定腸組織中TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln、二胺氧化酶(DAO)及血清DAO的含量
　　中下段2cm回腸組織稱重后制備組織勻漿，4℃下3000r/min離心15分鐘，取上清液，置于-20℃冰箱中保存待檢。TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln和DAO的檢測嚴格按照ELISA試劑盒（R&D公司，美國）說明書進行。
　　2.4.4、RT-PCR法測定腸

10、組織HIF-1αmRNA的表達
　　將下段2cm回腸組織經DEPC水沖凈后濾紙吸干，經液氮迅速冷卻后放入凍存管中，置于-80℃冰箱保存待檢。經腸組織總RNA的提取、逆轉錄、DNA擴增和瓊脂糖凝膠電泳等步驟檢測幼鼠腸組織HIF-1αmRNA的表達情況。
　　3.統計學處理
　　采用SPSS17.0統計軟件包進行統計學分析，計量資料以均數±標準差((x)±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差異法(

11、LSD-t)，以α=0.05為檢驗水準，即P＜0.05時，組間差異有統計學意義。
　　結果:
　　1.肉眼觀察，腹腔注射LPS后，1小時內L組與P組幼鼠開始出現渾身抖動，呼吸急促。2～3小時左右出現周身發(fā)涼，精神萎靡，活動度下降，并且進食減少。6小時左右出現明顯的倦怠乏力，幾乎不活動也不進食，甚者口唇青紫。P組幼鼠癥狀相對較輕，C組幼鼠活動、進食等情況正常。C組、L組及P組的24h生存率分別為100％、69.2％和92.3％

12、，幼鼠死亡主要發(fā)生在注射LPS后12～24小時期間。
　　2.與C組比較，L組和P組腸組織濕/干重比均顯著升高(P＜0.05);與L組比較，P組的這一比值顯著降低(P＜0.05)。差異均有統計學意義。
　　3.HE染色光鏡結果顯示:C組回腸絨毛結構完整，上皮細胞排列整齊，形態(tài)正常;L組可見絨毛細胞水腫，上皮細胞排列紊亂;P組絨毛水腫較L組明顯減輕，上皮細胞排列較整齊。
　　4.與C組比較，L組和P組腸組織TNF-α、I

13、L-6、HIF-1α的含量均升高(P＜0.05)，而Gln的含量降低(P＜0.05);與L組比較，P組腸組織Gln的含量較高(P＜0.05)，而余各指標的含量均較低(P＜0.05)。差異均有統計學意義。
　　5.與C組比較，L組和P組腸組織DAO含量均顯著降低，而血清DAO含量升高(P＜0.05);與L組比較，P組腸組織DAO含量較高，而血清DAO含量較低(P＜0.05)。差異均有統計學意義。
　　6.與C組比較，L組和P組