納豆菌(Bacillus natto T-2)環(huán)脂肽的分離純化及抗腫瘤作用機制研究.pdf

1、惡性腫瘤是造成人類死亡的第二號殺手,目前使用的化療藥物存在毒副作用大、耐藥性強等諸多問題。因此從天然產物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物已成為國內外研究的發(fā)展趨勢。本論文以納豆菌作為研究對象,圍繞其抗腫瘤活性物質的分離純化及其作用機制進行研究。
　　 首先從納豆菌代謝產物中,經(jīng)過酸沉醇提、凝膠層析等手段分離純化出具有明顯抗腫瘤活性的單一組分脂肽(BnCLP),其分子量為1072Da。紅外光譜分析表明該物質為環(huán)狀脂肽,氨基酸自動分析儀和

2、HPLC-MS/MS分析顯示該環(huán)脂肽的氨基酸序列為Leu-Len-Val-Asp-Leu-Glu-Leu。
　　 在此基礎上首次對BnCLP的抗腫瘤活性進行了系統(tǒng)研究。噻唑藍(MTT)實驗結果顯示BnCLP對人白血病K562細胞和乳腺癌MCF-7細胞均有較強的抑制作用,但在一定濃度范圍內,對來自正常組織的人成纖維HLF細胞卻無明顯的毒副作用。熒光顯微鏡、透射電鏡、原位缺口末端標記(TUNEL)以及乳酸脫氫酶(LDH)活力測定結果

3、,證明BnCLP主要是通過凋亡途徑抑制腫瘤細胞增殖。
　　 本論文在證明BnCLP對腫瘤細胞殺傷作用具有選擇性的基礎上,探討了BnCLP在K562細胞中誘導細胞凋亡的機制,目前尚未見相關報道。通過流式細胞儀考察BnCLP作用后細胞周期的變化,結果顯示BnCLP通過影響K562細胞的細胞周期而誘導了細胞的凋亡,K562細胞被阻遏于細胞周期的G1期,且這種G1期積累具有顯著的濃度和時間依賴性。激光共聚焦顯微鏡測定鈣離子濃度,發(fā)現(xiàn)Bn

4、CLP誘導的K562細胞凋亡與[Ca2+]I相關,BnCLP作用后細胞內[Ca2+]I升高,并隨著時間的延長[Ca2+]I也隨之升高。通過Western-blot方法測定p21、p27、CylinD1、MAPK、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Cytochrome c等相關蛋白的變化,同時還利用Caspase-9、Caspase-3、ERK、JNK、p38抑制劑考察它們對BnCLP作用的影響。結果顯示隨著BnCLP濃

5、度增大和作用時間的延長,p21、p27蛋白的表達率顯著增加,呈明顯的濃度依賴和時間依賴效應,而CylinD1則隨著藥物作用濃度增加和作用時間的延長表達量下調,表明p21、p27蛋白的上調表達及CylinD1的下調參與了BnCLP誘導K562細胞凋亡的過程,這一實驗結果與流式細胞檢測結果相吻合。采用Western-blot考察MAPK是否參與了BnCLP誘導的凋亡過程,結果表明BnC:P并未改變JNK和p38蛋白表達,對磷酸化的JNK和p

6、38表達也無明顯影響,但卻上調了ERK蛋白表達,對磷酸化的ERK表達也有一定的促進作用。為進一步驗證p38、JNK和ERK是否參與BnCLP誘導的K562細胞凋亡過程,測定了JNK、p38和ERK抑制劑對BnCLP引起的K562細胞凋亡的影響。結果表明ERK抑制劑可明顯抑制BnCLP誘導的細胞凋亡,而JNK、p38抑制劑對BnCLP誘導的細胞凋亡無顯著影響,這也進一步驗證了ERK參與了BnCLP誘導的K562細胞凋亡過程。為揭示[Ca2

7、+]I與ERK之間的關系,使用鈣離子抑制劑與BnCLP共同作用于K562細胞。結果表明鈣離子抑制劑能下調ERK蛋白的表達,對磷酸化的ERK表達也有一定的削弱作用,并抑制BnCLP誘導的細胞凋亡。在BnCLP誘導K562細胞的凋亡途徑中,Caspase-3和9被激活,Caspase-3,9抑制劑均可顯著抑制BnCLP引起的凋亡。應用Westen-blot法發(fā)現(xiàn)BnCLP可明顯上調促凋亡蛋白Bax的表達,而且同時下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表

8、達,表明BnCLP誘導的凋亡是由Caspase家族和Bcl-2家族共同調控的。而Bax過表達可改變線粒體膜通透性,釋放Cytochrome c,從而激活Caspase-9,再繼續(xù)激活下游的Caspase-3,形成一個正反饋調節(jié),從而擴大Caspase級聯(lián)反應。由此推測BnCLP的抗腫瘤作用機制為:納豆菌環(huán)脂肽作用K562細胞后,首先誘發(fā)[Ca2+]I濃度增加,繼而激活ERK及磷酸化ERK的上調,Caspase家族及Bcl-2家族共同調控

9、納豆菌環(huán)脂肽誘導的K562細胞凋亡,Caspase-3處于線粒體中的Bcl-2及Bax上游,Caspase-9則處于Bcl-2和Bax下游,而Bax的過表達可使Cytochrome c從線粒體釋放,與Apf-1及Caspase-9形成復合物,活化的Caspase-9進一步激活Caspase-3,這樣就完成了一個正反饋調控環(huán)。
　　 在體外實驗的基礎上,選用造模劑二甲基苯葸(DMBA)和甲基亞硝基脲(MNU)誘導大鼠乳腺癌,作為B

10、nCLP體內實驗的乳腺癌動物模型。通過給藥組和對照組的比較,測定BnCLP的體內抗腫瘤作用與毒副作用。結果顯示在抑瘤率與順鉑(DDP)相差不大的情況下,BnCLP對肝臟、腎臟的毒性明顯低于順鉑,平均體重和生存率也有一定程度的提高。通過對給藥組和對照組乳腺癌動物模型乳腺組織相關基因PCNA、ER和p53表達水平的測定,發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)BnCLP處理后,ER和p53基因表達水平均有一定程度的提高;PCNA基因表達水平受到了抑制。
　　 本