人FXYD6單克隆抗體庫的制備及其在膽管癌診斷中的應用.pdf

1、本研究分為三部分：
　　第一部分：
　　目的:構(gòu)建含人FXYD6胞內(nèi)區(qū)-G4S-FXYD6胞外區(qū)-G4 S-GST-His6TAG基因序列的原核表達質(zhì)粒,并誘導其表達,并對表達出的蛋白進行純化。
　　方法:構(gòu)建去除FXYD6跨膜區(qū)域的FXYD6胞內(nèi)區(qū)-G4S-FXYD6胞外區(qū)-G4S基因片段,插入原核表達載體 pET30a-GST中,以重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 BL21,SDS-PAGE檢測蛋白表達情況,重組蛋白

2、經(jīng)鎳柱純化后,SDS-PAGE檢測蛋白純度,BCA法檢測濃度。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了原核表達載體pET30a-GST-FXYD6,誘導后重組蛋白大小與預期相符在33kD-45kD之間,其純度在90％以上。
　　結(jié)論:成功制備出了FXYD6重組蛋白,為制備FXYD6胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的單克隆抗體庫奠定了基礎。
　　第二部分：
　　目的:研制抗人FXYD6功能區(qū)單克隆抗體庫,并對其進行簽定及篩選分泌胞內(nèi)、胞外區(qū)單克隆抗體

3、的雜交瘤細胞株。
　　方法:以去除跨膜區(qū)域FXYD6功能區(qū)重組蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合,經(jīng)多次篩選及克隆化,建立可穩(wěn)定分泌抗人FXYD6胞外區(qū)及胞內(nèi)區(qū)的單克隆抗體雜交瘤。用間接ELISA、蛋白免疫印跡簽定特異性及亞型,再用間接ELISA法通過合成的胞外區(qū)多肽篩選出分泌胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)的FXYD6單克隆抗體的雜交瘤細胞株,用免疫組化方法篩選可識別天然構(gòu)象的胞外區(qū)單克隆抗體,用腹水誘導法對

4、胞外區(qū)單克隆抗體進行制備、純化并檢測親和常數(shù)。用真核表達質(zhì)粒 pcDNATM3.1/myc-His(-) B-FXYD6瞬轉(zhuǎn)上調(diào)FXYD6蛋白表達的293T細胞在體外檢測胞外區(qū)抗體功能。
　　結(jié)果:成功制備了6株能持續(xù)分泌的胞內(nèi)區(qū)抗體的雜交瘤,2株持續(xù)分泌胞外區(qū)抗體的雜交瘤,這8株雜交瘤分泌的抗體可特異性識別天然構(gòu)象的人FXYD6蛋白,2種胞外區(qū)單克隆抗體的親和常數(shù)均在1010以上,這兩種抗體均屬于阻斷功能性單抗。
　　結(jié)論

5、:成功制備了分泌抗人FXYD6胞外區(qū)及胞內(nèi)區(qū)單克隆抗體的雜交瘤細胞庫和制備了兩種具有阻斷性功能的胞外區(qū)單抗,為進一步研究其組織分布及作用機制簽定了基礎。
　　第三部分：
　　目的:探討FXYD6蛋白在膽管癌組織及相應遠端正常膽管組織的表達情況,同時分析其在膽管癌中的表達與臨床病理學特征的關系。
　　方法:我們應用鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)免疫組織化學法檢測72例膽管癌和遠端正常膽管中FXYD6蛋白

6、的表達,分析FXYD6表達與膽管癌臨床病理學特征的關系。
　　結(jié)果:FXYD6在膽管癌組織中的陽性表達率明顯高于相應膽管組織的陽性表達率(69％vs.33.3％;p=0.002),而且FXYD6在高、中分化的膽管癌中的陽性表達明顯高于低分化及粘液癌中的陽性表達(85.7％ vs.40％;p=0.000)。FXYD6在正常膽管中的表達與解剖部位無關(p=0.945)。其在膽管癌中的表達與性別(p=0.393)、年齡(p=0.174)