人FXYD6單克隆抗體庫(kù)的制備及其在膽管癌診斷中的應(yīng)用.pdf

1、本研究分為三部分：
　　第一部分：
　　目的:構(gòu)建含人FXYD6胞內(nèi)區(qū)-G4S-FXYD6胞外區(qū)-G4 S-GST-His6TAG基因序列的原核表達(dá)質(zhì)粒,并誘導(dǎo)其表達(dá),并對(duì)表達(dá)出的蛋白進(jìn)行純化。
　　方法:構(gòu)建去除FXYD6跨膜區(qū)域的FXYD6胞內(nèi)區(qū)-G4S-FXYD6胞外區(qū)-G4S基因片段,插入原核表達(dá)載體 pET30a-GST中,以重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 BL21,SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況,重組蛋白

2、經(jīng)鎳柱純化后,SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度,BCA法檢測(cè)濃度。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a-GST-FXYD6,誘導(dǎo)后重組蛋白大小與預(yù)期相符在33kD-45kD之間,其純度在90％以上。
　　結(jié)論:成功制備出了FXYD6重組蛋白,為制備FXYD6胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的單克隆抗體庫(kù)奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分：
　　目的:研制抗人FXYD6功能區(qū)單克隆抗體庫(kù),并對(duì)其進(jìn)行簽定及篩選分泌胞內(nèi)、胞外區(qū)單克隆抗體

3、的雜交瘤細(xì)胞株。
　　方法:以去除跨膜區(qū)域FXYD6功能區(qū)重組蛋白作為免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,經(jīng)多次篩選及克隆化,建立可穩(wěn)定分泌抗人FXYD6胞外區(qū)及胞內(nèi)區(qū)的單克隆抗體雜交瘤。用間接ELISA、蛋白免疫印跡簽定特異性及亞型,再用間接ELISA法通過(guò)合成的胞外區(qū)多肽篩選出分泌胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)的FXYD6單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,用免疫組化方法篩選可識(shí)別天然構(gòu)象的胞外區(qū)單克隆抗體,用腹水誘導(dǎo)法對(duì)

4、胞外區(qū)單克隆抗體進(jìn)行制備、純化并檢測(cè)親和常數(shù)。用真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNATM3.1/myc-His(-) B-FXYD6瞬轉(zhuǎn)上調(diào)FXYD6蛋白表達(dá)的293T細(xì)胞在體外檢測(cè)胞外區(qū)抗體功能。
　　結(jié)果:成功制備了6株能持續(xù)分泌的胞內(nèi)區(qū)抗體的雜交瘤,2株持續(xù)分泌胞外區(qū)抗體的雜交瘤,這8株雜交瘤分泌的抗體可特異性識(shí)別天然構(gòu)象的人FXYD6蛋白,2種胞外區(qū)單克隆抗體的親和常數(shù)均在1010以上,這兩種抗體均屬于阻斷功能性單抗。
　　結(jié)論

5、:成功制備了分泌抗人FXYD6胞外區(qū)及胞內(nèi)區(qū)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞庫(kù)和制備了兩種具有阻斷性功能的胞外區(qū)單抗,為進(jìn)一步研究其組織分布及作用機(jī)制簽定了基礎(chǔ)。
　　第三部分：
　　目的:探討FXYD6蛋白在膽管癌組織及相應(yīng)遠(yuǎn)端正常膽管組織的表達(dá)情況,同時(shí)分析其在膽管癌中的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。
　　方法:我們應(yīng)用鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)72例膽管癌和遠(yuǎn)端正常膽管中FXYD6蛋白

6、的表達(dá),分析FXYD6表達(dá)與膽管癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。
　　結(jié)果:FXYD6在膽管癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于相應(yīng)膽管組織的陽(yáng)性表達(dá)率(69％vs.33.3％;p=0.002),而且FXYD6在高、中分化的膽管癌中的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于低分化及粘液癌中的陽(yáng)性表達(dá)(85.7％ vs.40％;p=0.000)。FXYD6在正常膽管中的表達(dá)與解剖部位無(wú)關(guān)(p=0.945)。其在膽管癌中的表達(dá)與性別(p=0.393)、年齡(p=0.174)