Th1炎癥在慢性變應(yīng)原暴露誘導(dǎo)小鼠氣道重塑中的作用和天龍咳喘靈抗重塑分子機(jī)制的探討.pdf

1、研究背景和目的： 慢性氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性是慢性哮喘共有的特征。與傳統(tǒng)Th2/Th1平衡理論相駁，最近眾多研究均顯示Th1炎癥可能在慢性變應(yīng)性哮喘發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)利用能夠在體示蹤氣道平滑肌細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞增殖活化的SMA-Cre/R26R轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠，通過慢性塵螨暴露建立慢性哮喘模型研究Th1炎癥在氣道重塑和氣道高反應(yīng)性(AHR)當(dāng)中的地位。天龍咳喘靈是根據(jù)我院廣東省名中醫(yī)邱志楠教授臨床驗(yàn)

2、方研制的中藥復(fù)方制劑，臨床和體外實(shí)驗(yàn)提示其具有治療氣道高反應(yīng)及抗肌纖維母細(xì)胞活化的作用。本研究在建立慢性哮喘小鼠模型及氣道反應(yīng)性體積描記法無創(chuàng)動態(tài)監(jiān)測技術(shù)平臺基礎(chǔ)上，深入探討并評價(jià)了該中藥方劑抗重塑效應(yīng)的特點(diǎn)，以及與表面激素發(fā)揮療效的不同控制環(huán)節(jié)和可能的臨床意義。 研究內(nèi)容和方法： 第一部分小鼠氣道反應(yīng)性檢測方法的建立、應(yīng)用和比較 第一節(jié)小鼠有創(chuàng)和無創(chuàng)氣道反應(yīng)性檢測方法對小鼠進(jìn)行連續(xù)18天的OVA霧化激發(fā)制造慢性

3、哮喘動物模型，分別使用有創(chuàng)和無創(chuàng)兩種方法對小鼠氣道反應(yīng)性進(jìn)行檢測，從中分析兩者及其相應(yīng)參數(shù)R1和Penh在反映氣道阻力當(dāng)中的相關(guān)性。 第二節(jié)小鼠運(yùn)動激發(fā)實(shí)驗(yàn)平臺跑步機(jī)的建立制造小鼠跑步機(jī)，為研究哮喘運(yùn)動激發(fā)試驗(yàn)搭建相應(yīng)平臺。 第二部分慢性塵螨變應(yīng)原暴露誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥的性質(zhì)、及相關(guān)的氣道重塑和氣道高反應(yīng)性的研究 1．使用本實(shí)驗(yàn)室建立的能夠在體示蹤氣道平滑肌細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞增殖活化的SMA-Cre/R26R轉(zhuǎn)基因

4、報(bào)告小鼠，連續(xù)經(jīng)鼻滴入塵螨溶液60天制作慢性變應(yīng)原暴露小鼠模型； 2．末次滴鼻24小時后利用有創(chuàng)性方法檢測氣道反應(yīng)性，支氣管肺泡灌洗(BALF)，計(jì)算BALF中細(xì)胞總數(shù)、分類計(jì)數(shù)； 3．肺組織病理切片分別進(jìn)行HE和LacZ染色，觀察各組小鼠肺組織的病理變化； 4．提取小鼠肺臟蛋白，Western Blot檢測α-SMA表達(dá)變化； 5．分離培養(yǎng)各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，以佛波酯、離子霉素刺激培養(yǎng)的脾細(xì)胞，莫能霉

5、素作為阻斷劑，流式細(xì)胞術(shù)檢測分泌IL-4和IFN-γ的CD3<'+>CD4<'+>脾細(xì)胞比例，檢測肺勻漿上清細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的水平。 第三部分中藥天龍咳喘靈水煎劑對支氣管哮喘小鼠氣道重塑的影響及其機(jī)制 1．小鼠隨機(jī)分為鹽水對照組，模型組，天龍咳喘靈水煎劑治療組和BUD治療組。除正常對照組，其它各組小鼠分別于第0、14日以O(shè)VA液腹腔注射致敏，第24天始每天給予霧化OVA溶液作激發(fā)，連續(xù)18天。每次激發(fā)后6小時

6、，天龍咳喘靈水煎劑治療組小鼠接受霧化3％中藥天龍咳喘靈生理鹽水治療，激素治療組接受1.67mg/ml BUD霧化作治療； 2．采用無創(chuàng)小鼠體積描記儀分別對最后一次激發(fā)后24小時(第41天)和96小時(第44天)小鼠的氣道反應(yīng)性進(jìn)行測定； 3．分別收集第41天和第44天小鼠BALF，細(xì)胞總數(shù)計(jì)算和分類計(jì)數(shù)； 4．肺組織病理切片HE和免疫組織化學(xué)檢查α-SMA染色； 5．Westem Blot檢測肺組織當(dāng)中α

7、-SMA、磷酸化ERK和STAT3水平。 結(jié)論： 1．成功利用有創(chuàng)和無創(chuàng)方法對小鼠氣道反應(yīng)性進(jìn)行檢測。經(jīng)分析，對于本實(shí)驗(yàn)所采用的Balb/c小鼠和造模方式，兩種方法具有較高的相關(guān)性，無創(chuàng)方法適合于本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中對氣道反應(yīng)性的動態(tài)檢測； 2．慢性塵螨變應(yīng)原暴露誘導(dǎo)了小鼠氣道Th1炎癥相關(guān)的氣道重塑和氣道高反應(yīng)性； 3．天龍咳喘靈水煎劑霧化能有效防治哮喘小鼠的氣道重塑，本方劑當(dāng)中可能存在某些天然化合物分子通過阻斷