Th1炎癥在慢性變應(yīng)原暴露誘導(dǎo)小鼠氣道重塑中的作用和天龍咳喘靈抗重塑分子機(jī)制的探討.pdf

1、研究背景和目的： 慢性氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性是慢性哮喘共有的特征。與傳統(tǒng)Th2/Th1平衡理論相駁，最近眾多研究均顯示Th1炎癥可能在慢性變應(yīng)性哮喘發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)利用能夠在體示蹤氣道平滑肌細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞增殖活化的SMA-Cre/R26R轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠，通過(guò)慢性塵螨暴露建立慢性哮喘模型研究Th1炎癥在氣道重塑和氣道高反應(yīng)性(AHR)當(dāng)中的地位。天龍咳喘靈是根據(jù)我院廣東省名中醫(yī)邱志楠教授臨床驗(yàn)

2、方研制的中藥復(fù)方制劑，臨床和體外實(shí)驗(yàn)提示其具有治療氣道高反應(yīng)及抗肌纖維母細(xì)胞活化的作用。本研究在建立慢性哮喘小鼠模型及氣道反應(yīng)性體積描記法無(wú)創(chuàng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)平臺(tái)基礎(chǔ)上，深入探討并評(píng)價(jià)了該中藥方劑抗重塑效應(yīng)的特點(diǎn)，以及與表面激素發(fā)揮療效的不同控制環(huán)節(jié)和可能的臨床意義。 研究?jī)?nèi)容和方法： 第一部分小鼠氣道反應(yīng)性檢測(cè)方法的建立、應(yīng)用和比較 第一節(jié)小鼠有創(chuàng)和無(wú)創(chuàng)氣道反應(yīng)性檢測(cè)方法對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)18天的OVA霧化激發(fā)制造慢性

3、哮喘動(dòng)物模型，分別使用有創(chuàng)和無(wú)創(chuàng)兩種方法對(duì)小鼠氣道反應(yīng)性進(jìn)行檢測(cè)，從中分析兩者及其相應(yīng)參數(shù)R1和Penh在反映氣道阻力當(dāng)中的相關(guān)性。 第二節(jié)小鼠運(yùn)動(dòng)激發(fā)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)跑步機(jī)的建立制造小鼠跑步機(jī)，為研究哮喘運(yùn)動(dòng)激發(fā)試驗(yàn)搭建相應(yīng)平臺(tái)。 第二部分慢性塵螨變應(yīng)原暴露誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥的性質(zhì)、及相關(guān)的氣道重塑和氣道高反應(yīng)性的研究 1．使用本實(shí)驗(yàn)室建立的能夠在體示蹤氣道平滑肌細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞增殖活化的SMA-Cre/R26R轉(zhuǎn)基因

4、報(bào)告小鼠，連續(xù)經(jīng)鼻滴入塵螨溶液60天制作慢性變應(yīng)原暴露小鼠模型； 2．末次滴鼻24小時(shí)后利用有創(chuàng)性方法檢測(cè)氣道反應(yīng)性，支氣管肺泡灌洗(BALF)，計(jì)算BALF中細(xì)胞總數(shù)、分類計(jì)數(shù)； 3．肺組織病理切片分別進(jìn)行HE和LacZ染色，觀察各組小鼠肺組織的病理變化； 4．提取小鼠肺臟蛋白，Western Blot檢測(cè)α-SMA表達(dá)變化； 5．分離培養(yǎng)各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，以佛波酯、離子霉素刺激培養(yǎng)的脾細(xì)胞，莫能霉

5、素作為阻斷劑，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分泌IL-4和IFN-γ的CD3<'+>CD4<'+>脾細(xì)胞比例，檢測(cè)肺勻漿上清細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的水平。 第三部分中藥天龍咳喘靈水煎劑對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道重塑的影響及其機(jī)制 1．小鼠隨機(jī)分為鹽水對(duì)照組，模型組，天龍咳喘靈水煎劑治療組和BUD治療組。除正常對(duì)照組，其它各組小鼠分別于第0、14日以O(shè)VA液腹腔注射致敏，第24天始每天給予霧化OVA溶液作激發(fā)，連續(xù)18天。每次激發(fā)后6小時(shí)

6、，天龍咳喘靈水煎劑治療組小鼠接受霧化3％中藥天龍咳喘靈生理鹽水治療，激素治療組接受1.67mg/ml BUD霧化作治療； 2．采用無(wú)創(chuàng)小鼠體積描記儀分別對(duì)最后一次激發(fā)后24小時(shí)(第41天)和96小時(shí)(第44天)小鼠的氣道反應(yīng)性進(jìn)行測(cè)定； 3．分別收集第41天和第44天小鼠BALF，細(xì)胞總數(shù)計(jì)算和分類計(jì)數(shù)； 4．肺組織病理切片HE和免疫組織化學(xué)檢查α-SMA染色； 5．Westem Blot檢測(cè)肺組織當(dāng)中α

7、-SMA、磷酸化ERK和STAT3水平。 結(jié)論： 1．成功利用有創(chuàng)和無(wú)創(chuàng)方法對(duì)小鼠氣道反應(yīng)性進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)分析，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)所采用的Balb/c小鼠和造模方式，兩種方法具有較高的相關(guān)性，無(wú)創(chuàng)方法適合于本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中對(duì)氣道反應(yīng)性的動(dòng)態(tài)檢測(cè)； 2．慢性塵螨變應(yīng)原暴露誘導(dǎo)了小鼠氣道Th1炎癥相關(guān)的氣道重塑和氣道高反應(yīng)性； 3．天龍咳喘靈水煎劑霧化能有效防治哮喘小鼠的氣道重塑，本方劑當(dāng)中可能存在某些天然化合物分子通過(guò)阻斷