系統(tǒng)性紅斑狼瘡MicroRNA表達(dá)譜和功能的初步研究.pdf

1、背景
　　 MicroRNAs（miRNAs）屬非編碼RNA大家族，高度保守，廣泛存在于從病毒、線蟲、植物到動物體內(nèi)，參與生物體的生長、發(fā)育、衰老、凋亡的調(diào)控。成熟miRNA通過核酸序列互補(bǔ)識別特定的目標(biāo)mRNA，使之降解或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。生物信息學(xué)預(yù)測約1/3的mRNA受miRNA調(diào)控。在免疫細(xì)胞中表達(dá)的miRNA超過100個(gè)，在固有免疫及適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用。近年來已經(jīng)有研究顯示

2、在一些疾病中某些特定的miRNA與疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，miRNA表達(dá)譜可以作為疾病的診斷和預(yù)后的指標(biāo)。
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是最為經(jīng)典的自身免疫病，其特征為多系統(tǒng)受累，體內(nèi)多種自身抗體產(chǎn)生、免疫復(fù)合物沉積在多種組織器官引起的免疫病理損傷，但具體的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。已經(jīng)有許多研究證實(shí)T、B細(xì)胞的功能異常在SLE的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。鑒于miRNA在調(diào)節(jié)T、B等免疫細(xì)胞中起重要作用，因此我們推測miRNA可

3、能在SLE的發(fā)病中同樣發(fā)揮著重要作用。外周血PBMC是研究miRNA在SLE免疫細(xì)胞作用很好的靶點(diǎn)，本研究從高通量篩選miRNA在SLE患者PBMC中表達(dá)差異入手，對miRNA在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行了初步研究。
　　 目的
　　 本研究通過篩選SLE患者PBMC中miRNA表達(dá)譜差異，尋找與SLE發(fā)病相關(guān)的miRNA，分析miRNA相對表達(dá)量與SLE臨床譜的相關(guān)性，初步探討了miR-125b在SLE中的可能的作用機(jī)

4、制。
　　 方法：
　　 1 MicroRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測847個(gè)成熟miRNAs在初治SLE和正常對照組間表達(dá)水平差異，應(yīng)用分層聚類分析篩選并獲得一批SLE特異性表達(dá)的miRNA分子，采用Real-timePCR方法對芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 2進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，采用Real-timePCR方法對miR-125b在SLE患者、正常對照組及疾病對照組的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，其中包括58例SLE患者、26例正常

5、對照、8例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者、8例干燥綜合征（pSS）患者，分析其與SLE臨床譜的相關(guān)性；采用流式細(xì)胞儀分選免疫細(xì)胞，Real-timePCR方法檢測miR-125b在不同免疫細(xì)胞中的相對表達(dá)量。
　　 3應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-125b的靶基因。構(gòu)建靶基因表達(dá)載體，通過雙熒光報(bào)告轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，體外運(yùn)用熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測過表達(dá)miR-125b后對雙熒光素酶報(bào)告基因活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1對847

6、個(gè)成熟miRNAs的表達(dá)譜檢測結(jié)果表明存在SLE特異性的miRNA表達(dá)譜。篩選并獲得了一批SLE特異性表達(dá)的miRNA分子，其中有37個(gè)miRNA在SLE和正常人PBMC中表達(dá)差異顯著，26個(gè)表達(dá)下調(diào)，11個(gè)表達(dá)上調(diào)，揭示了SLE患者PBMC中存在著特異的miRNA表達(dá)譜。進(jìn)一步用Real-time PCR對上述結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，得出相同結(jié)論。
　　 2擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)了miR-125b在SLE患者外周血PBMC中表達(dá)量明顯減

7、低，與正常對照比較有明顯差異，且降低幅度與SLE臟器受累相關(guān)。比較miR-125b在T、B細(xì)胞及非T、B細(xì)胞表達(dá)量中的差異發(fā)現(xiàn)miR-125b在T細(xì)胞表達(dá)差異最為明顯。
　　 3運(yùn)用TargetScan等軟件對miR-125b的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，根據(jù)軟件評分及基因功能選擇了Etsl、TNFAIP3和STAT3作為候選靶基因。構(gòu)建了Etsl、TNFAIP3和STAT3的雙熒光酶報(bào)告基因載體，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-125b可與Etsl