HCN2基因轉染脂肪干細胞自體移植治療完全性房室傳導阻滯的實驗研究.pdf

1、目的:本課題將細胞移植與基因治療相結合，構建HCN2重組腺病毒載體Ad.HCN2并體外轉染豬脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)以構建起搏細胞，并自體移植以有效起搏心室，從而治療完全性房室傳導阻滯。
　　 方法:
　　 (一)豬ADSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 獲取實驗豬頸部脂肪組織，0.075％Ⅱ型膠原酶分離得到ADSCs，將ADSCs培養(yǎng)于完全DMEM培養(yǎng)基中，每7

2、2 h換液1次，細胞融合達90％傳代培養(yǎng)；觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)學特點，繪制細胞生長曲線并檢測細胞周期；通過CD29、CD34、CD44、CD45、HLA-DR和c-kit的流式細胞儀檢測和免疫熒光染色檢測細胞表面標志；將ADSCs置入成脂肪、成骨、成軟骨、成肝細胞的誘導培養(yǎng)基進行誘導分化并鑒定分化細胞的性質。
　　 (二)Ad.HCN2的構建及其檢測
　　 擴增目的基因HCN2，構建重組質粒pShuttleCMV.HCN2

3、并行PCR和基因測序檢測；應用陽離子脂質體轉染法制備重組腺病毒Ad.HCN；將Ad.HCN2擴增、純化并行滴度測定；HeLa細胞檢測確定其使用安全性；Ad.GFP以不同感染倍數(shù)(multiplication ofinfection，MOI)轉染ADSCs后檢測轉染效率，確定最佳MOI；檢測Ad.GFP轉染ADSCs表達強度并繪制時間曲線；檢測Ad.HCN2轉染ADSCs后細胞活力與細胞周期變化；繪制轉染Ad.HCN2、Ad.Null以及

4、未轉染ADSCs的生長曲線，對比明確Ad.HCN2的安全性。
　　 (三)Ad.HCN2轉染豬ADSCs構建起搏細胞
　　 Ad.HCN2轉染ADSCs后，RT-PCR檢測HCN2 mRNA表達；免疫熒光檢測HCN2通道蛋白表達；流式細胞儀檢測HCN2表達陽性細胞百分比；Western-blot檢測HCN2蛋白；全細胞膜片鉗技術行電生理學檢測；分離培養(yǎng)乳鼠心肌細胞(neonatal rat'scardiomyocytes

5、，NRCs)并行免疫組織化學鑒定；聯(lián)合培養(yǎng)ADSCs和NRCs，觀察細胞搏動情況并記錄收縮頻率；加入異丙腎上腺素后觀察細胞收縮頻率變化；將Ad.HCN2轉染的ADSCs與NRCs聯(lián)合培養(yǎng)后，行抗縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)免疫熒光染色。
　　 (四)起搏細胞自體移植治療完全性房室傳導阻滯
　　 實驗豬植入心臟電子起搏器后，射頻消融希氏束建立完全性房室傳導阻滯動物模型；于右心室前壁自體移植ADSCs；

6、術后常規(guī)行體表心電圖和24 h動態(tài)心電圖檢查；分別注射異丙腎上腺素和阿托品以觀察實驗豬心率對神經(jīng)遞質的反應性；獲取細胞移植部位心室肌，分別行HE染色觀察和免疫熒光檢測。
　　 結論:
　　 (一)豬ADSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 ADSCs來源廣泛，脂肪組織抽取后殘留于供區(qū)的脂肪組織仍可擴增，容易大量獲得，對供區(qū)損傷小。ADSCs的分離效率較其他干細胞高，擴增能力強，傳代培養(yǎng)易于獲得大量有分化能力的細胞。AD

7、SCs表達CD29和CD44，顯示其具有間充質干細胞特性；ADSCs不表達CD34、CD45、c-kit，證明其為非造血類細胞。而其MHCⅡ相關蛋白HLA-DR近不表達，說明它們具有極少量與移植排斥相關的抗原分子，提示ADSCs具有免疫逃逸特性，具備異體移植的可能性。成脂、成骨、成軟骨及成肝細胞誘導結果證明ADSCs是具有多向分化能力的干細胞。
　　 (二)Ad.HCN2的構建及其檢測
　　 構建的重組腺病毒攜帶目的基因

8、HCN2。HeLa細胞未出現(xiàn)CPE，說明制備的重組腺病毒中未混有野生型病毒，體外轉染安全。MOI=50的Ad.GFP轉染率較高，且細胞狀態(tài)好，為了達到最佳量效比，后期實驗均選擇MOI=50作為標準的轉染倍數(shù)。Ad.GFP轉染ADSCs后，目的基因表達隨時間改變逐漸增強，在7 d左右表達強度最高，之后隨時間延長逐漸下降。Ad.HCN2轉染的ADSCs細胞活力和細胞周期無變化，Ad.HCN2對ADSCs無毒副作用。
　　 (三)Ad

9、.HCN2轉染豬ADSCs構建起搏細胞
　　 RT-PCR正實Ad.HCN2轉染ADSCs后，細胞內(nèi)有HCN2 mRNA合成。保溫試驗證實我們提取的RNA樣品純度高，可以滿足進一步實驗要求。Ad.HCN2轉染的ADSCs可表達HCN2基因。免疫熒光提示轉染細胞有HCN2蛋白表達，其表達后功能區(qū)域位于細胞膜。流式細胞儀檢測提示Ad.HCN2轉染的ADSCs細胞膜上HCN2通道蛋白的高表達。Western-blot檢測結果說明Ad.

10、HCN2轉染的ADSCs后可高效表達特異性目的蛋白HCN2。全細胞膜片鉗證實轉染細胞能產(chǎn)生If。ADSCs與NRCs聯(lián)合培養(yǎng)，Ad.HCN2轉染的ADSCs能有效起搏NRCs，并且對神經(jīng)遞質調節(jié)有良好的反應性。聯(lián)合培養(yǎng)后，ADSCs和NRCs之間可形成Cx43。
　　 (四)起搏細胞自體移植治療完全性房室傳導阻滯
　　 ADSCs自體移植后，起搏細胞可有效起搏心室。對比實驗組動物體表心電圖QRS波和起搏標測QRS波的形態(tài)