SENEX基因調(diào)控外周Treg細胞凋亡的臨床和實驗研究.pdf

1、調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cells，Treg）在維持機體自身免疫耐受、免疫自穩(wěn)平衡中起關(guān)鍵作用。Treg細胞功能數(shù)量的亢進或缺失將導致不同類型的免疫紊亂。一方面，Treg細胞過度累積、功能亢進會導致機體罹患惡性腫瘤等疾病的風險大大增加；而另一方面，Treg細胞數(shù)量功能缺陷又參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明，細胞凋亡是決定外周 Treg細胞數(shù)量的關(guān)鍵因素，但其確切機制未明。SENEX基因是新發(fā)現(xiàn)的、調(diào)控細胞凋亡的重要

2、基因，其對外周 Treg細胞凋亡的作用，目前未見相關(guān)報道。預(yù)實驗中，我們發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者 Treg細胞中SENEX基因表達特異性上調(diào)，而自身免疫性疾病患者外周血SENEX基因表達顯著下調(diào)。因此，我們提出“SENEX基因是調(diào)控Treg細胞凋亡的新基因”的假說，從Treg細胞免疫抑制亢進（惡性腫瘤）和免疫抑制缺陷（自身免疫性疾?。﹥蓚€不同方面，全面評估了SENEX基因在調(diào)控Treg細胞凋亡中的重要作用。
　　本課題首先分析了自身免疫性

3、疾病、膀胱癌兩種不同類型患者中Treg細胞表達情況，并初步分析 Treg表達變化的臨床意義，從正反兩個方面詮釋了外周Treg細胞在機體免疫系統(tǒng)中的重要作用；其次，我們檢測了自身免疫性疾病、膀胱癌患者外周血Treg細胞中SENEX基因及相關(guān)促凋亡的表達情況，結(jié)果表明SENEX基因上調(diào)可能是外周Treg細胞數(shù)量增加的原因，而SENEX基因表達下調(diào)與Treg細胞減少相關(guān)，提示SENEX基因可能通過多種途徑調(diào)控Treg細胞凋亡；最后，我們使用流

4、式分選的Treg細胞進行原代培養(yǎng)，應(yīng)用RNA干擾等技術(shù)證實，SENEX基因通過抑制促凋亡基因表達，拮抗外周Treg細胞凋亡?？傊?，本課題以外周 Treg細胞凋亡調(diào)控新基因為切入點，全面分析了不同類型患者中Treg細胞表達特點，從正反兩個方面證實了SENEX基因?qū)ν庵躎reg細胞凋亡的重要調(diào)控作用。本課題主要包括以下三個方面的研究內(nèi)容：
　　第一部分自身免疫性疾病、膀胱癌患者外周血Treg細胞和相關(guān)細胞因子檢測及其臨床意義
　

5、　目的：檢測健康人群、自身免疫性疾病及初診膀胱癌患者外周血中調(diào)節(jié)Treg細胞的比例、FoxP3基因mRNA水平及細胞因子TGF-β1、IL-10、IL-2、IL-17及TNF-α表達水平，同時探討Treg細胞、FoxP3基因表達與膀胱癌腫瘤臨床分期的相關(guān)性。
　　方法：收集23例初診自身免疫性疾病患者、38例初診膀胱癌患者、34例老年健康志愿者和36例青年健康志愿者外周血，留取血清，密度梯度離心分離出單個核細胞。以CD4+CD25

6、+CD127low作為Treg細胞的分子標記，分別應(yīng)用流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)C）、QRT-PCR及ELISA方法檢測上述標本中Treg細胞的比例、FoxP3 mRNA表達及血清細胞因子TGF-β1、IL-10、IL-2、IL-17和TNF-α的濃度。
　　結(jié)果：1. SLE和RA患者外周血Treg細胞比例顯著降低：SLE（3.12±0.35％）與RA（2.98±0.31%）患者外周血Treg細胞比例較老年對照

7、組（7.14±0.41%）及青年對照組（5.09±0.37%）均顯著降低，組間比較經(jīng)統(tǒng)計學分析差異有顯著意義。
　　2.膀胱癌患者及老年對照組外周血Treg細胞比例顯著增高：與青年對照組（5.09±0.37%）相比較，膀胱癌組及老年健康對照組的外周Treg細胞比例顯著增加，分別為（10.67±0.58%）和（7.14±0.41%）；同時，膀胱癌患者外周血Treg水平較老年健康對照組明顯增加，經(jīng)統(tǒng)計學分析兩組間差異有統(tǒng)計學意義。

8、r>　　3. SLE和RA患者外周血FoxP3基因mRNA表達顯著降低：與老年健康對照組及青年健康對照組比較，SLE（2-△△CT=0.0063±0.0041）及RA（2-△△CT=0.0071±0.0048）患者FoxP3基因 mRNA表達顯著降低，組間差異經(jīng)統(tǒng)計學分析有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　4.膀胱癌患者外周血FoxP3基因mRNA表達顯著增加：膀胱癌患者外周血FoxP3基因mRNA表達（2-△△CT=0.0272

9、±0.0081）要顯著高于青年健康對照組（2-△△CT=0.0097±0.0039）及老年健康對照組（2-△△CT=0.0184±0.0059），差異均有統(tǒng)計學意義（p﹤0.05）。老年健康對照組FoxP3基因mRNA表達與青年健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（p=0.241）。
　　5. RA患者外周血多種細胞因子分泌失調(diào)：與健康青年及老年對照組比較， RA患者血清IL-10(14.89±1.07 pg/ml)濃度顯著升高，差異

10、有統(tǒng)計學意義。與健康青年對照組比較，RA患者血清IL-2(565.73±38.07 pg/ml)和IL-17(18.86±4.72 pg/ml)濃度顯著升高，而血清TGF-β1(6.19±2.08 ng/ml)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（p﹤0.05）。SLE組細胞因子濃度經(jīng)統(tǒng)計學分析，與健康老年對照組及健康青年對照組均無顯著差異。
　　6.膀胱癌患者外周血多種細胞因子分泌紊亂：與健康青年及老年對照組比較，膀胱癌患者血清IL

11、-10(13.03±2.16 pg/ml)，IL-17(18.29±3.45 pg/ml)，TGF-β1(16.22±3.35 ng/ml)及TNF-α(25.18±5.74 pg/ml)濃度均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義。同時，膀胱癌患者(165.29±26.45 pg/ml)及健康老年對照組(196.69±32.38 pg/ml)血清IL-2濃度較健康青年對照組(409.24±90.81)明顯減少。此外，膀胱癌患者與健康老年對照組血清

12、IL-2濃度差異無統(tǒng)計學意義（p=0.383）。
　　7.膀胱癌外周血Treg細胞及Foxp3基因表達水平與腫瘤分期相關(guān)：21例70歲以上（含70歲）膀胱癌患者的外周血Treg細胞比例平均為12.38%，顯著高于70歲以下患者（Treg細胞比例平均為8.96%），兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（p=0.017）。同時，外周血Treg細胞比例與腫瘤浸潤明顯相關(guān)，TisT1Ta期膀胱癌患者Treg細胞比例（9.25%）要顯著低于T2~T4

13、期患者（12.13%），差異有統(tǒng)計學意義（p=0.006）。
　　21例70歲以上（含70歲）膀胱癌患者的外周血FoxP3基因表達（2-△△CT=0.0368）要顯著高于70歲以下患者（2-△△CT=0.0176），兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（p=0.024）。TisT1Ta期患者外周血外周血FoxP3基因表達（2-△△CT=0.0155）明顯低于T2~T4期患者（2-△△CT=0.0389），差異有統(tǒng)計學意義（p=0.043）。

14、此外，有淋巴結(jié)浸潤的膀胱癌患者，其外周血FoxP3基因表達（2-△△CT=0.0358）較無淋巴結(jié)浸潤患者（2-△△CT=0.0186）顯著增加（p=0.026）。
　　結(jié)論：SLE及RA患者外周血Treg細胞比例及FoxP3基因水平顯著降低；胱癌患者外周血Treg細胞及FoxP3基因表達水平顯著增加，同時其體內(nèi)存在多種細胞因子分泌紊亂；Treg細胞及FoxP3基因表達與膀胱癌腫瘤浸潤明顯相關(guān)，存在統(tǒng)計學相關(guān)性。因此，外周血CD4

15、+CD25+CD127lowTreg細胞是維持機體免疫自穩(wěn)平衡的關(guān)鍵因素。一方面，其數(shù)量缺陷可誘發(fā)機體過度免疫應(yīng)答，參與自身免疫性疾病的發(fā)生；另一方面，過度累積的Treg細胞通過細胞因子分泌等方式，過度抑制了機體的免疫反應(yīng)，又促進了膀胱癌的腫瘤生長、加速腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　第二部分自身免疫性疾病、膀胱癌患者SENEX基因及相關(guān)凋亡基因的表達特點
　　目的：檢測膀胱癌患者、健康志愿者外周血Treg細胞中SENEX基因和促凋亡基因P

16、53、 P16、 P21及 Caspase-3 mRNA水平，同時檢測健康人群、自身免疫性疾病患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中SENEX基因和促凋亡基因P53、 P16、 P21及 Caspase-3 mRNA表達。探討Treg細胞中SENEX基因mRNA表達與凋亡基因表達、細胞因子濃度之間的相關(guān)性。
　　方法：收集23例初診自身免疫性疾病患者、16例初診膀胱

17、癌患者、10例老年健康志愿者和12例青年健康志愿者外周血，留取血清，密度梯度離心分離出單個核細胞。應(yīng)用流式細胞術(shù)純化分選外周血CD4+CD25hiTreg/CD4+CD25-Teff細胞，采用QRT-PCR方法檢測Treg/Teff細胞和PBMCs中SENEX基因和促凋亡基因P53、P16、 P21及 Caspase-3 mRNA的表達水平，使用Pearson相關(guān)分析探討SENEX基因與促凋亡基因mRNA水平及血清細胞因子濃度之間的相關(guān)

18、性。
　　結(jié)果：1.膀胱癌患者及健康對照組Treg細胞流式細胞分選純度檢測：共有16例膀胱癌患者、12例健康青年志愿者和10例健康老年志愿者成功獲得了CD4+CD25hiTreg/CD4+CD25-Teff細胞亞群，經(jīng)檢測提示 CD4+CD25+CD127lowTreg細胞純度均在90%以上。
　　2.膀胱癌患者及健康對照組外周血Treg/Teff細胞中SENEX基因表達特點：與老年健康對照組及青年健康對照組Tr e g細胞

19、比較，膀胱癌患者外周血CD4+CD25hiTreg中SENEX基因表達顯著增加，經(jīng)統(tǒng)計學分析組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。同時，膀胱癌患者Treg細胞中的SENEX基因表達亦較Teff細胞明顯增加。在健康老年對照組及青年對照組，外周血Treg細胞SENEX基因表達均略高于Teff細胞，但經(jīng)統(tǒng)計學分析差異均顯著無意義（p=0.186）。
　　3.膀胱癌患者外周血Treg/Teff細胞中促凋亡基因表達特點：與Teff細胞相比較

20、，膀胱癌患者Treg細胞中凋亡基因P53、 P16、 P21及 Caspase-3的表達均顯著減少，經(jīng)統(tǒng)計學分析組間差異均有顯著意義（p<0.05）。
　　4.膀胱癌患者Treg細胞SENEX基因與P53表達、TGF-β1及IL-2濃度相關(guān)：SENEX基因mRNA表達與凋亡基因P53 mRNA水平、細胞因子TGF-β1和IL-2濃度顯著相關(guān)，有統(tǒng)計學意義。其中，SENEX基因表達與凋亡基因P53 mRNA水平、血清IL-2濃度呈明

21、顯負相關(guān)，與血清TGF-β1水平呈顯著正相關(guān)。
　　5.自身免疫性疾病患者PBMCs中SENEX基因表達特點：與老年健康對照組(2-△△CT=0.1130±0.0065)及青年健康對照組PBMCs(2-△△CT=0.1955±0.0482)比較，RA患者PBMCs中SENEX基因表達(2-△△CT=0.0354±0.0015)顯著降低，經(jīng)Mann-Whitney U檢驗分析組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。在SLE患者，其PB

22、MCs中SENEX基因表達(2-△△CT=0.0842±0.0281)略低于健康青年對照組及健康老年對照組，但經(jīng)統(tǒng)計學分析差異均無統(tǒng)計學意義（p=0.452）。
　　6.自身免疫性疾病患者PBMCs中凋亡基因表達特點：與健康老年對照組及健康青年對照組相比較， RA患者PBMCs中促凋亡基因P53和Caspase-3基因的mRNA表達水平均顯著增加，經(jīng)Mann-Whitney U檢驗分析組間差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05），而RA

23、患者PBMCs中P16和P21的mRNA表達變化無統(tǒng)計學意義。在SLE患者，其PBMCs中促凋亡基因P53、 P16、 P21及 Caspase-3 mRNA表達水平與健康老年對照組及健康青年對照比較，差異均無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：RA患者PBMCs中SENEX基因表達下調(diào)，而促凋亡基因P53和Caspase-3的表達增加。膀胱癌患者外周血Treg細胞高表達SENEX基因，而促凋亡基因P53、P16、 P21及 Caspase-

24、3的mRNA表達水平均顯著降低。同時，SENEX基因表達與凋亡基因P53、血清TGF-β1及IL-2濃度明顯相關(guān)。SENEX基因可能通過下調(diào)促凋亡基因P53表達，拮抗Treg細胞凋亡，促進其在膀胱癌患者外周血中的累積。此外，SENEX基因表達上調(diào)還增加膀胱癌患者TGF-β1水平，抑制IL-2分泌。因此， SENEX基因是參與調(diào)控外周Treg細胞凋亡的新基因。
　　第三部分 SENEX基因拮抗外周CD4+CD25hiTreg細胞凋亡

25、的體外實驗研究
　　目的：檢測膀胱癌患者外周血Treg/Teff細胞在體外短期原代培養(yǎng)時的自發(fā)細胞凋亡率，觀察氧化應(yīng)激損傷對Treg/Teff細胞凋亡的影響，研究SENEX基因mRNA表達對Treg/Teff細胞凋亡的影響，探討SiRNA-SENEX轉(zhuǎn)染對Treg細胞促凋亡基因mRNA表達的影響。觀察RA患者PBMCs原代培養(yǎng)時自發(fā)凋亡特點，研究SENEX基因RNA干擾對RA患者PBMCs凋亡的影響。
　　方法：收集4例健康

26、志愿者、5例初診類RA患者和5例初診膀胱癌患者外周血，留取血清，密度梯度離心分離出單個核細胞。應(yīng)用流式細胞術(shù)純化分選外周血CD4+CD25hiTreg/CD4+CD25-Teff細胞，并在體外進行短期原代培養(yǎng)，采用100μM H2O2溶液誘導氧化應(yīng)激性損傷。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性抑制Treg/Teff細胞中SENEX基因表達，采用QRT-PCR方法檢測Treg/Teff細胞中SENEX基因和促凋亡基因P53、P16、P21及 Casp

27、ase-3 mRNA的表達水平，使用流式檢測AnnexinⅤ(+)凋亡細胞比例。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性抑制RA患者PBMCs中SENEX基因表達，觀察SENEX基因表達受抑對PBMCs細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：1.膀胱癌患者Treg/Teff細胞原代培養(yǎng)24h自發(fā)凋亡檢測：在相同培養(yǎng)條件下，經(jīng)24h短期培養(yǎng)，膀胱患者外周血Treg細胞自發(fā)凋亡率(AnnexinⅤ+細胞比例：3.53±0.17%)要顯著低于Teff細胞（5.78

28、±0.46%），實驗結(jié)果表明膀胱癌外周Treg細胞具有凋亡抵抗的特征。
　　2.不同劑量H2O2誘導Treg/Teff細胞凋亡檢測：不同劑量H2O2對Treg和Teff細胞均有不同程度的凋亡誘導作用，H2O2誘導的Treg/Teff細胞凋亡具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，在25μM、50μM、100μM及150μM H2O2處理Treg細胞2h時后，即刻檢測其凋亡率分別為：4.3±0.32%、4.9±0.48%、5.7±0.41%及9.7±0

29、.95%；而25μM、50μM、100μM及150μM H2O2處理Teff細胞2h時后，其凋亡率分別為：5.1±0.53%、5.7±0.76%、6.8±0.75%及11.7±1.04%。相同劑量H2O2誘導細胞凋亡時，Teff細胞的誘導凋亡率均高于Treg細胞，差異有統(tǒng)計學意義。
　　3. SENEX基因RNA干擾細胞模型的建立：體外構(gòu)建了SENEX基因SiRNA轉(zhuǎn)染Treg/Teff細胞模型后， real-time PCR檢測

30、結(jié)果提示，在使用脂質(zhì)體LipofectaininTM2000轉(zhuǎn)染SiRNA-SENEX時，Treg和Teff細胞中SENEX mRNA表達抑制率均達到80%以上。
　　4. SENEX基因可以拮抗H2O2誘導的Treg細胞凋亡：使用100μM H2O2處理2h，可顯著增加膀胱癌患者Treg和Teff細胞凋亡率（分別為11.2±2.6%和13.1±4.3%）；同時在相同的處理條件下， SENEX-SiRNA轉(zhuǎn)染可顯著增加Treg細胞

31、凋亡率（21.5±3.4%）；而在Teff細胞（13.9±3.1%）中，則沒有觀察到由SENEX基因介導的抗凋亡作用。
　　5. SiRNA-SENEX轉(zhuǎn)染顯著增加Treg細胞中凋亡基因mRNA表達：使用100μM H2O2處理2h誘導細胞凋亡時，在RNA干擾特異性抑制SENEX基因表達24h后，檢測Treg細胞中相關(guān)凋亡基因的表達情況。結(jié)果表明，使用RNA干擾抑制SENEX mRNA的表達，會顯著增加Treg細胞中P53、 P1

32、6、 P21及 Caspase-3 mRNA（2-△△CT=6705.73±1124.07、253.08±16.01、154.58±35.12及5135.79±985.47）的表達。
　　6.初診RA患者PBMCs自發(fā)凋亡率檢測：在相同培養(yǎng)條件下，經(jīng)24h短期培養(yǎng)，初診RA患者PBMCs自發(fā)凋亡率(AnnexinⅤ+細胞比例：4.96±0.31%)要顯著高于健康志愿者 PBMCs（3.75±0.36%），實驗結(jié)果表明初診RA患者P

33、BMCs自發(fā)凋亡率顯著增加。
　　7.不同劑量地塞米松誘導PBMCs凋亡檢測：不同劑量地塞米松對RA患者PBMCs均有不同程度的凋亡誘導作用，地塞米松誘導的PBMCs凋亡具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，在0×(5×10-2)mg/L、1×(5×10-2)mg/L、2×(5×10-2)mg/L、5×(5×10-2)mg/L、10×(5×10-2)mg/L、50×(5×10-2)mg/L及100×(5×10-2)mg/L地塞米松處理 RA患者PB

34、MC24h時后，即刻檢測其細胞凋亡率分別為：19.0±4.18%、21.4±3.95%、22.9±4.99%、23.4±5.48%、23.9±5.17%、23.5±5.11%及23.8±5.32%；而0×(5×10-2)mg/L、1×(5×10-2)mg/L、2×(5×10-2)mg/L、5×(5×10-2)mg/L、10×(5×10-2)mg/L、50×(5×10-2)mg/L及100×(5×10-2)mg/L地塞米松處理健康志愿者P

35、BMC24h時后，其凋亡率分別為：16.3±3.76%、18.5±4.21%、19.3±5.07%、20.1±4.12%、19.9±4.02%、20.6±3.29%及20.2±4.28%。結(jié)果顯示，相同劑量地塞米松誘導PBMCs凋亡時，RA患者的細胞凋亡率要顯著高于健康志愿者，進一步說明RA患者PBMCs更易發(fā)生細胞凋亡。
　　8. SiRNA-SENEX轉(zhuǎn)染顯著增加地塞米松誘導的PBMCs凋亡：使用5×10-2 mg/L地塞米松

36、處理8h，可顯著增加RA患者和健康志愿者PBMCs細胞凋亡率（分別為6.1±2.75%和5.2±1.04%）；而在相同的處理條件下，SENEX-SiRNA轉(zhuǎn)染可同時顯著增加RA患者（13.5±2.86%）和健康志愿者（10.6±2.95%）的PBMCs細胞凋亡率。
　　結(jié)論：無論是自發(fā)凋亡還是H2O2誘導的氧化應(yīng)激性損傷時，膀胱癌Treg細胞均較Teff細胞凋亡減少，具有凋亡抵抗的特征。使用RNA干擾抑制SENEX基因mRNA表達

37、，會顯著增加Treg細胞氧化應(yīng)激損傷的凋亡率。SENEX基因通過抑制促凋亡基因表達，抑制膀胱癌患者外周血Treg細胞凋亡，促進外周血Treg細胞比例的增加，從而為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫逃逸提供有利的免疫微環(huán)境。此外， SiRNA-SENEX轉(zhuǎn)染進一步增加RA患者PBMCs細胞凋亡，亦從反面佐證了SENEX基因調(diào)控Treg細胞凋亡的結(jié)論。SENEX基因有望成為外周Treg細胞免疫干預(yù)的潛在靶點，相關(guān)研究為自身免疫性疾病、惡性腫瘤的臨床防治