結(jié)核分枝桿菌中參與膽固醇降解的CYP450酶催化體系的功能研究.pdf

1、結(jié)核病至今仍為嚴(yán)重的傳染病，每年的致死率仍高居傳染病殺手第二位。特別是近年來，耐多藥結(jié)核分枝桿菌和泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)及傳播，對(duì)臨床上現(xiàn)用抗生素的有效治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，給人們的健康造成極大的隱患，因此我們急需尋找新型抗結(jié)核作用靶標(biāo)，以篩選新型抗結(jié)核藥物。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌基因組編碼20種細(xì)胞色素P450酶，這些P450酶在細(xì)菌體內(nèi)均發(fā)揮著著至關(guān)重要的生理功能。以CYP125A1和CYP142A1為例，因在膽固醇的降解與利用中發(fā)揮

2、重要的作用，被認(rèn)為是潛在的抗結(jié)核作用靶標(biāo)。然而，在P450酶催化體系中介導(dǎo)CYP125A1和CYP124A1電子傳遞的電子傳遞鏈蛋白至今仍未闡明。
　　 本論文主要目的是對(duì)結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞色素P450酶的電子傳遞鏈蛋白進(jìn)行深入研究，并對(duì)參與膽固醇降解的P450酶的電子傳遞鏈進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析。我們首先采用大腸埃希菌作為宿主，克隆結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中所有P450酶的電子傳遞鏈蛋白的編碼基因從而進(jìn)行外源性表達(dá)，包括鐵氧還蛋白還

3、原酶(FDR)、所有鐵氧還蛋白(FDX)和4種P450酶，并從恥垢分枝桿菌中分離出7Fe-8S鐵氧還蛋白MSFdxA;然后以2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)或細(xì)胞色素C為電子受體評(píng)價(jià)FDR對(duì)NADH和NADPH的氧化活性以及FDR與不同F(xiàn)DX的偶聯(lián)作用；最后我們采用HPLC分析P450酶對(duì)4-膽甾烯-3-酮的代謝作用，進(jìn)而研究P450酶催化體系中電子傳遞鏈蛋白與P450酶之間的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌中參與膽固醇降解的P450酶的電子

4、傳遞鏈蛋白。本研究成功表達(dá)了3個(gè)FDR（FdrA、FprA和FdxB的鐵氧還蛋白還原酶結(jié)構(gòu)域）、3個(gè)FDX(Fdx、FdxD和Rv1786)和4個(gè)P45O酶（CYP125A1、CYP124A1、CYP142A1和CYP143A1），從恥垢分枝桿菌中分離出MSFdxA替代FdxA、FdxC和FprBX進(jìn)行研究，獲得了結(jié)核分枝桿菌P450酶電子傳遞鏈蛋白的所有類型組分；系統(tǒng)比較分析了3個(gè)FDR對(duì)NADH和NADPH的氧化活性以及這3個(gè)FDR

5、與6個(gè)FDX的偶聯(lián)情況；建立了相應(yīng)的HPLC方法分析參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞鏈。研究表明，與FdrA偶聯(lián)作用最強(qiáng)的鐵氧還蛋白是FdxD和Rv1786，與FprA偶聯(lián)作用最強(qiáng)的是Fdx和MSFdxA，spFDX次之；FprA可以作為參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞鏈的FDR組分，F(xiàn)drA不是參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞鏈的FDR組分，spFDX、MSFdxA和FdxD可以作為參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞鏈的FDX組

6、分，spFDX對(duì)CYP125A1和CYP142A1電子傳遞作用較強(qiáng)，MSFdxA對(duì)CYP124A1電子傳遞作用較強(qiáng)，F(xiàn)dx、Rv1786不是參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞鏈的FDX組分。
　　 因此我們推測(cè)FprA/FdxA、FprA/FdxC和（或）FprB可能是結(jié)核分枝桿菌中參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞鏈，進(jìn)一步明確了參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞機(jī)制，并為建立以參與膽固醇降解P450酶催化體系作為藥物靶標(biāo)提供