循環(huán)肝癌細(xì)胞分子表型鑒定在指導(dǎo)索拉非尼個體化治療中的應(yīng)用潛能研究.pdf

1、研究背景和目的
　　Ras/Raf/ERK信號通路是肝癌細(xì)胞中較為活躍的信號通路之一，也是目前唯一的肝癌靶向藥物索拉非尼的主要作用靶點。但是據(jù)報道，臨床肝癌組織樣本只有23%（25/109）表達(dá)pERK[1]，而pERK是Ras/Raf/ERK信號通路中的一個關(guān)鍵性分子。這意味著相當(dāng)部分肝癌患者可能先天性缺乏對索拉非尼的敏感性。另外據(jù)報道，索拉非尼療效通常持續(xù)時間有限，其獲得性耐藥的機制在于 Ras/Raf/ERK通路受抑后PI3

2、K/AKT/mTOR通路獲得代償性活化[2]。因此，不僅在決定索拉非尼用藥前需要篩查藥物靶點，而且在用藥過程中需要不斷監(jiān)測其耐藥狀態(tài)。遺憾的是，目前臨床上尚沒有建立指導(dǎo)索拉非尼個體化治療的實驗室診斷技術(shù)。至于受檢樣本，我們認(rèn)為在無法獲取或需要反復(fù)獲取肝癌樣本的情況下，從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）由于可多次實時采集則是最為理想的選擇。為此，本課題在篩查臨床肝癌組織樣本藥物靶點的基礎(chǔ)上，將以肝癌CTCs為樣本，建

3、立同時檢測上述兩條通路中的兩個代表性靶分子pERK和pAKT的多色免疫熒光染色方法，并通過臨床檢測，評價該方法的可行性以及用于指導(dǎo)索拉非尼個體化治療肝癌的潛能。
　　方法
　　1、應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測18例臨床肝癌組織連續(xù)切片中pAKT和pERK表達(dá)，了解肝癌組織的pAKT/pERK表達(dá)譜。
　　2、將差異表達(dá)pAKT/pERK的不同肝癌細(xì)胞系分別摻入外周血（外周血肝癌CTCs模型），建立和優(yōu)化在鑒定肝癌 CTCs

4、的基礎(chǔ)上檢測其 pAKT/pERK表達(dá)的多色免疫熒光染色技術(shù)，其中鑒定肝癌CTCs的標(biāo)志物采用目前國際上通行的廣譜細(xì)胞角蛋白（pan-cytokeratin）抗體。
　　3、采用Ficoll密度梯度離心法從臨床肝癌血樣中富集CTCs，采用離心涂片法制作細(xì)胞涂片。
　　4、采用上述所建立的多色免疫熒光染色方法檢測30例臨床肝癌CTCs樣本中pAKT/pERK表達(dá)，繪制肝癌CTCs的pAKT/pERK表達(dá)譜。
　　5、比較

5、肝癌 CTCs與對應(yīng)的肝癌組織 pAKT/pERK表達(dá)檢測結(jié)果，分析二者之間的相關(guān)性。
　　6、應(yīng)用索拉非尼治療8例晚期肝癌患者，比較治療前后外周血CTCs數(shù)量及其pAKT/pERK表達(dá)譜變化情況，并統(tǒng)計相關(guān)臨床病理資料及隨訪生存信息，初步評估肝癌CTCs計數(shù)及其pAKT/pERK表達(dá)譜檢測在指導(dǎo)索拉非尼個體化治療中的應(yīng)用潛能。
　　結(jié)果
　　1、建立的CKs/pAKT/pERK多色免疫熒光染色方法可在鑒定肝癌CTCs

6、的同時檢測其pAKT/pERK表型，可準(zhǔn)確檢測出不同細(xì)胞之間pAKT和pERK的表達(dá)差異。
　　2、在HCC組織中檢測到4種不同的pAKT/pERK表型，分別為pAKT+/pERK+、pAKT+/pERK-、pAKT-/pERK+和pAKT-/pERK-。在18例肝癌患者中，pAKT+/pERK+患者2例，占11.1%，pAKT+/pERK-患者13例，占72.2%，pAKT-/pERK+患者2例，占11.1%，pAKT-/pER

7、K-患者1例，占5.6%。其中pAKT+患者共15例，占83.3%， pERK+患者共4例，占22.2%。
　　3、在HCC CTCs中也檢測到與組織對應(yīng)的4種不同的pAKT/pERK表型。
　　4、不同肝癌個體的CTCs之間pAKT/pERK表型不盡相同。在30例HCC外周血中，28例檢出CTCs，檢出率93.3%，平均31±18個。不同HCC患者具有不同表型的CTCs。28例檢出CTCs的HCC患者中4種表型分別為：pA

8、KT+/pERK+5例，占17.9%；pAKT+/pERK-18例，占64.3%；pAKT-/pERK+3例，占10.7%；pAKT-/pERK-2例，占7.1%。其中pAKT陽性患者共23例，占82.1%，pERK陽性患者共8例，占28.6%。
　　5、同一肝癌個體的不同CTCs之間pAKT/pERK表型也不盡相同。28例患者中，除5例患者體內(nèi)僅檢測到1種表型的CTCs外，其余大部分患者體內(nèi)同時檢測到2種或以上表型的CTCs，甚

9、至同時檢測到全部4種表型的CTCs，不同表型的CTCs數(shù)目存在差異，占所有檢出CTCs的比例也不相同。
　　6、肝癌 CTCs與對應(yīng)的肝癌組織 pAKT/pERK表達(dá)檢測結(jié)果高度一致，不同pAKT/pERK分型兩種方法檢測結(jié)果之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。在同時應(yīng)用兩種方法檢測的18例患者中，除1例未檢出CTCs，其余17例中有16例檢測結(jié)果一致，占94%。其中1例組織學(xué)檢測結(jié)果為pERK-，此例患者外周血檢出27個CTCs，

10、但在這27個CTCs中檢測出8個pERK+CTCs。
　　7、8例HCC患者在接受索拉非尼治療后2周，外周血CTCs均有不同程度下降，從用藥前31±10個下降到20±12個。其中2例CTCs表型為pAKT-/pERK+的患者， CTCs數(shù)目下降程度最為顯著，分別從26個和27個下降至5個和7個，下降幅度分別為80.8%和74.1%；2例CTCs表型為pAKT+/pERK+的患者，CTCs數(shù)目下降程度較小，分別從27個和25個下降至

11、15個和13個，下降幅度分別為40.7%和48.0%；3例CTCs表型為pAKT+/pERK-的患者及1例CTCs表型為pAKT-/pERK-的患者， CTCs數(shù)目下降幅度不大，從31個、36個、53個和24個分別下降到25個、29個、43個和20個，下降幅度分別為19.3%、19.4%、18.9%和16.7%。不同分子表型CTCs下降幅度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明 pAKT-/pERK+患者對索拉非尼最為敏感， pAKT+/pERK+患

12、者次之，而pAKT+/pERK-患者和pAKT-/pERK-患者對索拉非尼不敏感。
　　結(jié)論
　　建立的 CKs/pAKT/pERK多色免疫熒光染色方法簡便實用，可用于肝癌 CTCs pAKT/pERK表型鑒定；肝癌CTCs可以替代肝癌組織進(jìn)行pAKT/pERK分子表型檢測，甚至具有更多優(yōu)勢；不同肝癌個體的CTCs之間以及同一肝癌個體的不同CTCs之間pAKT/pERK表型存在異質(zhì)性；肝癌CTCs pAKT/pERK表型檢測