HSPA1A啟動子熒光素酶報告基因HepG2細(xì)胞體系的建立和在環(huán)境污染物毒性評估中的應(yīng)用.pdf

1、近年來,基于細(xì)胞應(yīng)激基因啟動子調(diào)控的熒光素酶報告基因?qū)嶒炓殉蔀樽罹哂袧摿Φ亩拘栽u估方法之一。
　　熱休克反應(yīng)是以熱休克蛋白的誘導(dǎo)合成為主要特征的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。在眾多的HSPs家族中,最為重要的是由HSPA1A基因編碼HSPA1A蛋白。HSPA1A通常參與蛋白質(zhì)的合成和折疊,錯誤折疊蛋白質(zhì)的正確折疊和降解。當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激因素作用后,胞質(zhì)中的熱休克因子被激活并進(jìn)入細(xì)胞核與位于HSPA1A啟動子區(qū)域的熱休克元件結(jié)合,激活HSPA1A

2、基因的轉(zhuǎn)錄,啟動HSPA1A蛋白的表達(dá)。由于該基因?qū)Ω鞣N環(huán)境應(yīng)激因素十分敏感,HSPA1A基因的表達(dá)逐漸成為環(huán)境污染物對細(xì)胞或生物體早期毒性效應(yīng)的一種敏感的標(biāo)志物。目前,基于HSPA1A基因啟動子調(diào)控的熒光素酶報告基因?qū)嶒炓殉蔀槌Ｓ玫沫h(huán)境污染物毒性評估方法之一。盡管有研究者選用了HSPA1A啟動子調(diào)控的熒光素酶報告基因細(xì)胞體系來評估重金屬、有機(jī)氯化合物、城市廢水等水體和土壤污染物的毒性,但是,利用HSPA1A啟動子熒光素酶報告基因技術(shù)來

3、評估多環(huán)芳烴、甲醛、汽車尾氣和焦?fàn)t逸散物等單一和復(fù)合空氣污染物的毒性的研究鮮有報道。
　　基于上述研究,本研究擬構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSPA1A啟動子調(diào)控的熒光素酶報告基因質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞體系(HepG2/HSAPA1A細(xì)胞),并用該細(xì)胞來綜合評價空氣中常見的單一和復(fù)合化學(xué)污染物的毒性。芘、苯并[a]芘、甲醛、汽車尾氣和焦?fàn)t逸散物等環(huán)境污染物作用HepG2/HSAPA1A細(xì)胞后,分別測定細(xì)胞的熒光素酶活性、存活率、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的丙

4、二醛(MDA)濃度、細(xì)胞的DNA損傷水平和微核率,并將HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系與細(xì)胞存活率實驗、MDA實驗、單細(xì)胞凝膠電泳和微核實驗分別進(jìn)行比較來評價HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系在化學(xué)污染物的綜合毒性評估中的應(yīng)用和該細(xì)胞體系的敏感性。本研究的假設(shè)是 HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系的熒光素酶活性可以敏感地反映環(huán)境污染物對細(xì)胞的綜合毒性效應(yīng)。本研究共分為三部分:
　　第一部分 HSPA1A啟動子熒光素酶報告基因HepG2

5、細(xì)胞體系的建立
　　本研究運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)來構(gòu)建HSPA1A啟動子熒光素酶報告基因HepG2細(xì)胞體系。首先,構(gòu)建了pGL4.17/HSPA1A重組質(zhì)粒,然后將經(jīng)酶切和測序鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中,并用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2/HSPA1A細(xì)胞。最后,對HepG2/HSAPA1A細(xì)胞體系進(jìn)行鑒定。分別用Western blotting實驗和Luciferase assay system試劑盒測定42℃熱休克1h

6、后37℃恢復(fù)不同時間的HepG2/HSAPA1A細(xì)胞的HSPA1A的表達(dá)水平和熒光素酶活性。Western blotting結(jié)果顯示,與未熱休克對照組相比,熱休克后HepG2/HSPA1A細(xì)胞的HSPA1A的表達(dá)水平升高,且在恢復(fù)培養(yǎng)4h后達(dá)到峰值,隨后下降。3次獨立實驗分析結(jié)果顯示,恢復(fù)培養(yǎng)4h后HSPA1A的表達(dá)水平是對照組的3倍。與對照組相比,熱休克后細(xì)胞的相對熒光素酶活性均顯著增加(P<0.01),且與HSPA1A的表達(dá)水平呈相

7、似的變化趨勢。熱休克恢復(fù)培養(yǎng)4h后細(xì)胞的相對熒光素酶活性達(dá)到峰值,為對照組的9倍。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示HSPA1A的表達(dá)水平與細(xì)胞的相對熒光素酶活性呈顯著正相關(guān)。熱休克是經(jīng)典的引起熱休克反應(yīng)的應(yīng)激條件。熱休克后,HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系的HSPA1A的表達(dá)水平明顯升高,HSPA1A基因的啟動子也增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄,這些研究結(jié)果表明HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系已構(gòu)建成功,且該細(xì)胞體系可以用于敏感地評估環(huán)境應(yīng)激因素對細(xì)胞的

8、早期毒性效應(yīng)。
　　第二部分 HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系在評價空氣中單一化學(xué)污染物毒性中的應(yīng)用
　　為了研究HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系在空氣中單一化學(xué)污染物毒性評估中的應(yīng)用,用空氣中常見的三種單一化學(xué)污染物作用HepG2/HSPA1A細(xì)胞24 h后,分別測定細(xì)胞的相對熒光素酶活性、細(xì)胞存活率、氧化損傷水平(MDA濃度)和遺傳損傷水平(Olive TM值和微核率)。研究結(jié)果顯示,芘染毒后,HepG2/HSPA1A細(xì)

9、胞的相對熒光素酶活性隨著染毒劑量的增加而逐漸增加,與對照相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在最高染毒劑量下(100μM),細(xì)胞的相對熒光素酶活性為對照組的2.4倍。不同濃度的苯并[a]芘染毒HepG2/HSPA1A細(xì)胞后,細(xì)胞的相對熒光素酶活性均顯著增加。在染毒20μM時,細(xì)胞的相對熒光素酶活性是對照組的2.7倍。較低劑量的甲醛(1μM)也能顯著增加細(xì)胞的相對熒光素酶活性,且在最高染毒劑量(40μM)下,細(xì)胞的相對熒光素酶活性為

10、對照組的1.6倍。芘染毒后,細(xì)胞的相對熒光素酶活性僅與 MDA濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。苯并[a]芘和甲醛染毒后,細(xì)胞的相對熒光素酶活性與Olive TM值及細(xì)胞微核率均呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。引起細(xì)胞的相對熒光素酶活性顯著增加所需的芘、苯并[a]芘和甲醛的劑量是等于或低于細(xì)胞存活率顯著降低、MDA濃度顯著增加、細(xì)胞Olive TM值和微核率顯著增加所需的最低劑量。這些研究結(jié)果表明HepG2/HSPA1A細(xì)胞的熒光素酶活性

11、不僅可以作為單一化學(xué)污染物所誘導(dǎo)的細(xì)胞早期損傷的一個敏感的指標(biāo),而且可以綜合反映單一化學(xué)污染物所誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷和遺傳損傷等毒性效應(yīng)。HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系可以用于評估空氣中單一化學(xué)污染物的綜合毒性。
　　第三部分 HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系在評價空氣中復(fù)合化學(xué)污染物毒性中的應(yīng)用
　　本部分將進(jìn)一步探討該細(xì)胞體系是否可以用于評估空氣中的復(fù)合化學(xué)污染物的毒性。汽車尾氣是人類生活環(huán)境中的污染物的一個重要來源,大

12、多數(shù)個體每天都會暴露于一定量的汽車尾氣。焦?fàn)t逸散物是燃煤型污染物的代表,其中含有大量的致癌性有毒物質(zhì),嚴(yán)重威脅著作業(yè)工人的身體健康。故本部分選擇在交通擁擠的街道及焦化廠工人不同作業(yè)區(qū)分別采集空氣樣本,并研究這些空氣樣本對HepG2/HSPA1A細(xì)胞的各種毒性效應(yīng)。結(jié)果顯示,不同濃度的汽車尾氣作用細(xì)胞后,細(xì)胞的相對熒光素酶活性均顯著增加。且在0.6ng/l的劑量作用下,細(xì)胞的相對熒光素酶活性是對照組的1.4倍。在最低染毒劑量(6pg/l)

13、作用下,細(xì)胞的相對熒光素酶活性與對照組相比,差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。爐底焦?fàn)t逸散物染毒細(xì)胞組的相對熒光素酶活性顯著增加,與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。且在0.15μg/l的劑量作用下,細(xì)胞的相對熒光素酶活性最高,為對照組的1.4倍。細(xì)胞的相對熒光素酶活性隨著爐側(cè)和爐頂焦?fàn)t逸散物濃度的增加而逐漸增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在爐側(cè)和爐頂焦?fàn)t逸散物染毒最高濃度時(65.4μg/l,202μg/l)

14、,細(xì)胞的相對熒光素酶活性分別為對照組的2.1和5.3倍。汽車尾氣樣本作用后,細(xì)胞的相對熒光素酶活性與Olive TM值及細(xì)胞微核率均呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。爐底焦?fàn)t逸散物作用后細(xì)胞的相對熒光素酶活性與MDA濃度呈顯著正相關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.404,P<0.05)。爐底、爐側(cè)和爐頂焦?fàn)t逸散物染毒后,HepG2/HSPA1A細(xì)胞的相對熒光素酶活性均與Olive TM值、細(xì)胞微核率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。在低劑量的汽車尾

15、氣(0.006ng/l)和焦?fàn)t逸散物(0.006μg/l)作用下,細(xì)胞的相對熒光素酶活性已顯著增加,該劑量是等于或低于細(xì)胞存活率顯著降低、MDA濃度顯著增加、細(xì)胞Olive TM值和微核率顯著增加所需的最低劑量。這些研究結(jié)果表明,HepG2/HSPA1A細(xì)胞的熒光素酶活性可以敏感地反映汽車尾氣和焦?fàn)t逸散物對細(xì)胞的毒性效應(yīng)。熱休克反應(yīng)是非特異性的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng),HepG2/HSPA1A細(xì)胞的熒光素酶活性能夠綜合反映復(fù)合化學(xué)污染物對細(xì)胞的早期

16、損傷。故HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系可以用于評估環(huán)境復(fù)合污染物的綜合毒性。
　　綜上所述,本課題的主要研究結(jié)果如下:(1)三種單一化學(xué)污染物(芘、苯并[a]芘和甲醛)和兩種復(fù)合化學(xué)污染物(汽車尾氣和焦?fàn)t逸散物)作用后,HepG2/HSPA1A細(xì)胞的相對熒光素酶活性均顯著增加,非致癌的芘和較低濃度的汽車尾氣(pg/l)也能顯著增加細(xì)胞的熒光素酶活性;(2)在很低的劑量作用下(pg/l)即可觀察到細(xì)胞的相對熒光素酶活性顯著增加,這

17、些劑量是等于或小于細(xì)胞存活率顯著降低,細(xì)胞氧化損傷和遺傳損傷水平顯著增加所需的最低劑量,HepG2/HSPA1A細(xì)胞的熒光素酶活性可以作為環(huán)境污染物對細(xì)胞早期損傷的一個敏感指標(biāo);(3)所有的待測定的環(huán)境污染物作用后,HepG2/HSPA1A細(xì)胞的相對熒光素酶活性與細(xì)胞的氧化損傷和遺傳損傷水平(MAD濃度、Olive TM值和微核率)之間呈顯著正相關(guān),HepG2/HSPA1A細(xì)胞的熒光素酶活性可以綜合反映環(huán)境化學(xué)污染物所誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷