基于蛋白組學技術研究卷柏總黃酮及穗花杉雙黃酮降糖作用機制.pdf

1、目的：采用2型糖尿病大鼠模型，應用蛋白組學技術研究卷柏總黃酮的降糖作用，同時建立HepG2細胞胰島素抵抗模型，研究卷柏總黃酮及其主含成分穗花杉雙黃酮改善糖尿病胰島素抵抗的作用機制。
　　方法：1、Wistar大鼠喂以高糖高脂飼料誘發(fā)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，8周后腹腔注射35mg/kg STZ建立2型糖尿病模型。以100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg濃度的卷柏總黃酮連續(xù)給藥8周，脫頸椎處死動物后，提取大鼠肝臟總蛋白

2、進行蛋白組學研究，通過 PDQuest軟件分別比較正常組、模型組和給藥組蛋白質(zhì)電泳圖譜的變化，確定豐度發(fā)生三倍以上變化的差異蛋白點，經(jīng)質(zhì)譜分析和蛋白數(shù)據(jù)庫檢索，獲得差異蛋白點鑒定結(jié)果，初步闡釋卷柏總黃酮發(fā)揮降血糖作用的作用特點及潛在作用機制，從而為卷柏總黃酮臨床前研究打下基礎。同時檢測大鼠血糖、血脂水平及胰島素、胰高血糖素的分泌，初步驗證卷柏總黃酮發(fā)揮降血糖作用的作用特點。采用光鏡切片觀察胰腺、肝臟及腎臟細胞的損傷修復狀況，同時檢測大鼠

3、肝腎功能相關指標和炎癥因子水平對蛋白組學結(jié)果進行驗證。2、建立 HepG2細胞胰島素抵抗模型，提取細胞總蛋白并進行蛋白組學研究，獲得了分辨率高、重復性好的雙向電泳圖譜。通過 PDQuest軟件分別比較正常組、模型組和給藥組蛋白質(zhì)電泳圖譜的變化，確定豐度發(fā)生三倍以上變化的差異蛋白點，經(jīng)質(zhì)譜分析和蛋白數(shù)據(jù)庫檢索，獲得差異蛋白點鑒定結(jié)果，同時采用Western-blot和ELISA法對蛋白組學結(jié)果加以驗證，初步闡釋卷柏總黃酮及其主含成分穗花杉

4、雙黃酮對胰島素抵抗的改善作用及作用機制。
　　結(jié)果：1、蛋白組學結(jié)果顯示，采用雙向電泳技術分離得到195個蛋白點，通過軟件分析得到差異蛋白點，切取具有3倍差異的30個蛋白點進行質(zhì)譜檢測，分析蛋白信息并歸屬通路后發(fā)現(xiàn)卷柏總黃酮發(fā)揮降血糖作用的作用機制涉及PI3K-Akt信號通路及下游的NF-κB通路、P53通路等，也均能改善糖尿病大鼠的糖代謝紊亂，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。大鼠脫頸椎處死后，對生化指標的檢測發(fā)現(xiàn)卷柏總黃酮各劑量組能夠明顯降低大

5、鼠FBG水平（P＜0.01），改善大鼠胰島素抵抗狀況，降低胰高血糖素（P＜0.05或 P＜0.01），升高HDL水平（P＜0.05或P＜0.01），降低TG、CHOL、LDL水平（P＜0.05或P＜0.01），卷柏總黃酮能夠促進胰島素的分泌（P＜0.05）；HE染色結(jié)果顯示，卷柏總黃酮可修復受損的胰島細胞和肝細胞；為了對蛋白組學的實驗結(jié)果進行驗證我們檢測了NF-κB信號通路下游炎癥因子的表達水平，結(jié)果表明卷柏總黃酮能顯著降低IL-8、T

6、NF-α、CRP等炎癥因子的水平（P＜0.05或P＜0.01）。2、為了進一步研究卷柏總黃酮及穗花杉雙黃酮發(fā)揮降糖作用的作用機制，采用高糖及高胰島素的培養(yǎng)環(huán)境誘導HepG2細胞產(chǎn)生胰島素抵抗，而給予卷柏總黃酮及穗花杉雙黃酮之后，細胞葡萄糖消耗率明顯的升高，提取總蛋白進行蛋白組學研究，采用雙向電泳技術分離得到148個蛋白點，通過PDQuest軟件分析得到差異蛋白，切取3倍差異的20個蛋白點進行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜分析結(jié)果表明卷柏總黃酮及穗花杉雙