鴨疫里默氏桿菌1型磷酸二酯酶基因的發(fā)現(xiàn)及其克隆表達(dá)和應(yīng)用研究.pdf

1、血清1型鴨疫里默氏桿菌CH-1株表達(dá)型DNA文庫(kù)的免疫篩選以兔抗鴨疫里默氏桿菌陽(yáng)性血清對(duì)RA血清1型CH-1株表達(dá)型DNA文庫(kù)中已通過(guò)藍(lán)白斑篩選的一個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行原位雜交篩選。經(jīng)過(guò)5次免疫篩選后，陽(yáng)性斑經(jīng)過(guò)體內(nèi)刪除、噬菌粒經(jīng)酶切分析和序列測(cè)定，得到一段4434bp的插入DNA片段，并將序列遞交GenBank，獲得登錄號(hào)為EF030421。 鴨疫里默氏桿菌1型磷酸二酯酶基因的發(fā)現(xiàn)及其生物信息學(xué)分析運(yùn)用NCBI的BLASTN、BLA

2、STP、ORFFinder、ConservedDomains、EMBL的FASTA等程序?qū)ζ渲幸粋€(gè)命名為ORF1689的開(kāi)放閱讀框架進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示ORF1689起始密碼子上游存在核糖體結(jié)合位點(diǎn)，完整ORF含1689bp，編碼562個(gè)氨基酸(aa)，其編碼蛋白的理論分子量為59.5kD，等電點(diǎn)為5.82。ORF1689具有phosphodiest蛋白家族的保守區(qū)域，與丙桿菌屬的Caulobactersp.K31、鞘氨

3、醇單胞菌(Sphingomonassp.)、Sphingopyxisalaskensis和Novosphingobiumaromaticivorans的1型磷酸二酯酶基因的氨基酸序列同源性分別為49.283％、38.716％、38.693％和38.313％，表明該基因是一種新的1型磷酸二酯酶基因。 鴨疫里默氏桿菌1型磷酸二酯酶基因的原核表達(dá)及表達(dá)重組蛋白的高免血清的制備根據(jù)所提交的序列的PDE1基因段設(shè)計(jì)一對(duì)引物，從血清1型鴨疫

4、里默氏桿菌CH-1株中擴(kuò)增出PDE1基因并將其克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)PCR、酶切和DNA測(cè)序鑒定之后，將PDE1基因正向插入原核表達(dá)載體pET-32a(+)的BamHⅠ和HindⅢ位點(diǎn)間，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-PDE1。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-PDE1轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出大小約為80KD的PDE1重組蛋白。對(duì)重組蛋白進(jìn)行了可溶性與不可溶性分析，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物主要以不溶性包

5、涵體的形式存在。同時(shí)對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及IPTG濃度進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳表達(dá)條件。 采用鎳金屬螯合介質(zhì)填料(Ni-NTASuperflow)對(duì)重組蛋白進(jìn)行親和層析純化，得到高純度的重組蛋白。以兔抗RA陽(yáng)性血清進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果表明該重組表達(dá)蛋白具有較好的免疫原性。以純化的重組蛋白為抗原免疫家兔制備多克隆血清，并對(duì)血清進(jìn)行了純化和ELISA效價(jià)檢測(cè)，為進(jìn)一步研究該基因提供關(guān)鍵技術(shù)材料。 基于PDE1重組蛋白檢測(cè)RA

6、感染的ELISA方法的建立與應(yīng)用以PDE1重組蛋白為包被抗原(重組蛋白量為5ug/mL)建立了檢測(cè)RA感染的ELISA方法。結(jié)果表明當(dāng)OD450＞0.271時(shí)即判定為陽(yáng)性，當(dāng)OD450≤0.271時(shí)即判定為陰性。且該方法可以特異性地區(qū)別臨床上鴨瘟病毒病、鴨乙肝病毒病、鴨病毒性肝炎病、鴨大腸桿菌病和鴨沙門(mén)氏菌病。表明該法可以作為鴨疫里默氏桿菌感染的臨床診斷和檢測(cè)。 基于兔抗重組1型磷酸二酯酶蛋白抗體的免疫組化方法和免疫熒光方法檢測(cè)

7、RA建立和比較利用純化的兔抗PDE1重組蛋白IgG抗體建立了檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌的間接免疫組化方法和間接免疫熒光方法。兩種方法對(duì)鴨瘟、鴨源禽流感、鴨病毒性肝炎、鴨大腸桿菌、鴨沙門(mén)氏菌、鴨多殺性巴氏桿菌感染發(fā)病和死亡雛鴨組織進(jìn)行檢測(cè)，不出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，而檢測(cè)RA人工感染發(fā)病死亡雛鴨，可在心肌、肝臟、脾臟、肺臟、胰臟、腎臟、法氏囊、哈德氏腺、胸腺、腦、十二指腸、直腸、盲腸中檢測(cè)到RA抗原，RA抗原主要分布于細(xì)胞漿、組織間隙和血液中。通過(guò)試驗(yàn)比較

8、，間接免疫組化和間接免疫熒光檢測(cè)RA抗原定位的結(jié)果基本一致，也與我實(shí)驗(yàn)室劉維平建立的利用抗RA全血清的間接免疫組化法檢測(cè)出的規(guī)律相一致。證明了1型磷酸二酯酶基因是RA的一個(gè)標(biāo)志性基因。 鴨疫里默氏桿菌1型磷酸二酯酶重組蛋白的免疫原性研究分別采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)?zāi)旯ザ颈Ｗo(hù)實(shí)驗(yàn)對(duì)PDE1重組蛋白進(jìn)行免疫原性研究。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備純化的兔抗PDE1重組蛋白抗體與PDE1重組蛋白能特異性地結(jié)合。 將PDE1重組蛋白與等量的