喹烯酮臨床前毒理學(xué)研究.pdf

1、本文為評(píng)價(jià)喹烯酮的安全性，進(jìn)行了系統(tǒng)的臨床前毒性試驗(yàn)。測(cè)定喹烯酮的急性毒性，致突變性，亞慢性毒性，喂養(yǎng)致畸毒性和繁殖毒性，計(jì)算ADI(每日容許攝入量)和其在動(dòng)物性食品中的最高殘留限量。為喹烯酮的開發(fā)應(yīng)用提供毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)依據(jù)。 1.急性毒性試驗(yàn)。 Wistar大鼠和昆明小鼠各60只，雌雄各半，喹烯酮用0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC)助溶制成混懸液，同時(shí)設(shè)同類藥物喹乙醇、卡巴氧和痢菌凈作為對(duì)照，采用一次性灌胃染毒，觀察1

2、4d內(nèi)的中毒反應(yīng)，用寇氏法計(jì)算半數(shù)致死量和95％的可信限。結(jié)果表明，喹烯酮對(duì)Wistar大鼠和昆明小鼠的經(jīng)口LD<,50>分別為8687.31和15848.93mg/kg b.W.；喹乙醇、卡巴氧和痢菌凈對(duì)Wistar大鼠經(jīng)口LD<,50>分別為1877.63、878.01和562.34 mg/kg b.W.對(duì)昆明小鼠經(jīng)口LD<,50>分別為3677.56、2815.51和694.44 mg/kg b.W.。按照急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)喹烯酮為

3、實(shí)際無毒物質(zhì)，喹乙醇、卡巴氧和痢菌凈都為低毒物質(zhì)。 2.遺傳毒性研究。 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變(Ames)試驗(yàn)試驗(yàn)菌株為TA<,97>，TA<,98>，TA<,100>，TA<,102>，TA<,1535>，TA<,1537>。試驗(yàn)劑量為1.0，2.6，6.9，18.2，50.0μg/皿，用已知的陽(yáng)性物作陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照(二甲亞砜(DMSO))和空白對(duì)照(蒸餾水)，加和不加S9混合液的對(duì)照。每個(gè)處理作3個(gè)平行平皿

4、，采用平皿摻入法，計(jì)數(shù)各皿回變菌落數(shù)，結(jié)果評(píng)價(jià)為計(jì)算各處理平均每皿誘發(fā)回變菌落數(shù)與相應(yīng)的空白對(duì)照組的平均每皿自發(fā)回變菌落數(shù)的比值(MR)，如MR大于2為陽(yáng)性，小于2為陰性。 試驗(yàn)結(jié)果表明，喹烯酮對(duì)TA<,102>和TA<,1535>加與不加S<,9>時(shí)都為陰性；TA<,97>加和不加S9在劑量≥6.9μg/皿時(shí)均為陽(yáng)性；TA<,95>加和不加S<,9>在劑量為50.0μg/皿時(shí)均為陽(yáng)性；TA<,100>加和不加S<,9>在劑量≥

5、18/2μg/皿時(shí)均為陽(yáng)性；TAl537加S9在劑量≥6.9μg/皿時(shí)為陽(yáng)性，不加S9在劑量≥18.2μg/皿時(shí)為陽(yáng)性。作為對(duì)照藥物，喹賽多的結(jié)果與喹烯酮基本相似，喹乙醇、卡巴氧和痢菌凈對(duì)各菌株均為陽(yáng)性結(jié)果，并呈一定的劑量.反應(yīng)關(guān)系。小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)昆明種小鼠按體重隨機(jī)分組，每組10只，雌雄各半，試驗(yàn)分組分別為溶劑對(duì)照組(0.5％CMC)，喹烯酮組(1700，3600，7200mg/kg b.w.)，陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺(CP)40

6、mg/kg b.w.)，并設(shè)藥物對(duì)照喹賽多組(3600，6000，10000mg/kg b.W.)、喹乙醇組(400，700，1700mg/kg b.w.)、卡巴氧(350，700，1400mg/kgb.w.)和痢菌凈(90，175，350mg/kg b.w.)。各組經(jīng)口灌胃給藥2次，間隔24h，于末次給藥后6h采樣制片。每只小鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算含微核的嗜多染紅細(xì)胞(MNPCE)數(shù)和含微核的嗜多染紅細(xì)胞率，同時(shí)計(jì)數(shù)嗜多染

7、紅細(xì)胞(PCE)和正染紅細(xì)胞(NCE)的比例。 結(jié)果表明，溶劑對(duì)照組和喹烯酮、喹賽多各劑量組含微核嗜多染紅細(xì)胞率與陰性對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組和喹乙醇組、卡巴氧組及痢菌凈組微核率顯著增加，與陰性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)。各組小鼠的.PCE/NCE均>1.0，表明各藥物對(duì)小鼠骨髓未呈明顯的細(xì)胞毒性作用，紅細(xì)胞的形成未受到抑制，不影響微核計(jì)數(shù)。陰性對(duì)照組含微核多染紅細(xì)胞率<3‰，符合一般自發(fā)率。喹烯

8、酮、喹賽多微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性，喹乙醇、卡巴氧和痢菌凈微核試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)以中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞V79株為測(cè)試系統(tǒng)，設(shè)喹烯酮組(1.25、2.5、5.0、10.0μg/mL)藥物對(duì)照喹乙醇組、卡巴氧組、痢菌凈組(劑量同喹烯酮組)和喹賽多組(0.625、1.25、2.5、5.0μg/mL)，并設(shè)溶劑對(duì)照組(DMSO)和陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)分別在加或不加S<,9>混合物的條件下進(jìn)行，不加S<,9>混合物在加

9、入受試物24、48h后制片；加S9混合物在加入受試物6h后換液，培養(yǎng)至24h制片。每一劑量計(jì)數(shù)200個(gè)中期分裂相細(xì)胞，計(jì)算畸變細(xì)胞率。 試驗(yàn)結(jié)果表明，喹烯酮和喹賽多各劑量組在加與不加S<,9>時(shí)細(xì)胞畸變率均小于5％，為陰性。喹乙醇、卡巴氧和痢菌凈在加與不加S<,9>時(shí)細(xì)胞畸變率均大于10％，為陽(yáng)性。 3.90d喂養(yǎng)試驗(yàn)。 SPF級(jí)Wistar大鼠400只，按體重隨機(jī)分為5組，每組雌雄各40只。設(shè)喹烯酮試驗(yàn)組，劑量

10、為50、300、1800mg/kg飼料；藥物對(duì)照喹乙醇組，劑量為300mg/kg飼料；空白對(duì)照組，飼以不添加藥物的飼料。雌雄分籠飼養(yǎng)。各組均連續(xù)飼喂14周。每周稱量動(dòng)物體重和飼料，計(jì)算飼料利用率。分別于用藥后在第30d、60d、90d時(shí)每組撲殺大鼠雌雄各10只，余下大鼠給予基礎(chǔ)飼料飼喂1周后撲殺。取全血作血常規(guī)檢驗(yàn)，血清作生化指標(biāo)檢驗(yàn)，并進(jìn)行病理剖檢和病理組織學(xué)檢查，主要臟器稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。結(jié)果表明，大鼠在90d內(nèi)，喹烯酮50mg/

11、kg和300mg/kg飼料組尿常規(guī)、血常規(guī)和生化指標(biāo)與空白相比無顯著差異(p>0.05)，組織病理學(xué)檢查也未發(fā)現(xiàn)與藥物有關(guān)的異常病變。1800mg/kg喹烯酮組大鼠的平均體重極顯著低于對(duì)照組(p<0.01)。喹烯酮1800mg/kg組和300mg/kg喹乙醇組大鼠的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性顯著低于空白組(p<0.05)，腎、肝、睪丸(帶附睪)的臟器系數(shù)顯著大于空白組(p<0.05)，尿常規(guī)、血常規(guī)和其他生化指標(biāo)均沒有異常變化。組織病理學(xué)

12、觀察表明，喹烯酮1800mg/kg和喹乙醇300mg/kg飼料組部分大鼠肝臟匯管區(qū)膽管增生。喹烯酮對(duì)Wistar大鼠亞慢性毒作用的靶器官為肝臟，與喹乙醇相同。喹烯酮亞慢性最大未觀察的有害作用劑量(NOAEL)為300mg/kg飼料，相當(dāng)于30mg/kg b.W.。 4.喂養(yǎng)致畸試驗(yàn)。 SPF級(jí)Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為5組，每組雌性24只，雄性12只。設(shè)喹烯酮試驗(yàn)組(50、300、1800mg/kg飼料)，藥物對(duì)照喹

13、乙醇組(300mg/kg飼料)，空白對(duì)照組。各組均連續(xù)飼喂12周后進(jìn)行交配。妊娠第20d剖腹進(jìn)行畸胎檢查?；z查包括測(cè)窩重、活胎數(shù)、死胎數(shù)、胎鼠體重、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)等。試驗(yàn)結(jié)果表明，喹烯酮1800mg/kg組胎鼠體重、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)和窩重極顯著低于空白對(duì)照組(p<0.01)，死胎數(shù)極顯著高于空白對(duì)照組(p<0.01)。各組均未出現(xiàn)明顯的與藥物相關(guān)的外觀和內(nèi)臟畸形?？瞻捉M、喹烯酮1800mg/kg飼料組與喹乙醇300mg/kg飼料組各出現(xiàn)2例、

14、1例和1例多肋變異，但與空白組比較差異不顯著。除此之外未發(fā)現(xiàn)明顯的骨骼畸形。喹烯酮致畸試驗(yàn)NOAEL為300mg/kg飼料，相當(dāng)于30mg/kg b.w.。 5.二代繁殖試驗(yàn)。 SPF級(jí)Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為5組，第一代每組雌性30只，雄性15只；第二代每組雌性24只，雄性12只。設(shè)喹烯酮試驗(yàn)組(50、300、1800mg/kg飼料)，藥物對(duì)照喹乙醇組(300mg/kg飼料)，空白對(duì)照組。各組均連續(xù)飼喂10周后進(jìn)

15、行交配。試驗(yàn)中觀察親代及子代動(dòng)物的體重、飼料利用率、胎仔平均體重等指標(biāo)，取其生殖器官進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，并計(jì)算繁殖指數(shù)。結(jié)果表明，F(xiàn)<,0>代和F<,1>喹烯酮1800mg/kg組胎鼠體重和飼料利用率低于空白對(duì)照組，窩平均活崽數(shù)和第2ld平均仔重與空白對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)。組織病理學(xué)檢查未見各組大鼠生殖器官受到損傷。喹烯酮對(duì)大鼠生殖發(fā)育毒性的NOAEL為300mg/kg飼料，相當(dāng)于30mg/kg b.w.。 6.

16、計(jì)算每日容許攝入量(ADI)及最高殘留限量 根據(jù)上述各試驗(yàn)結(jié)果得到喹烯酮的NOAEL為30mg/kg b.w.，按照FDA的ADI和最高殘留限量公式，計(jì)算其ADI為0.03mg/kg b.w；在肌肉、肝臟、腎臟和脂肪的最高殘留限量分別為6.0、18.0、36.0和36.0mg/kg。實(shí)際給藥時(shí)動(dòng)物組織中原藥及代謝物的殘留量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于最高殘留限量。所以，喹烯酮的安全性很高。 上述試驗(yàn)均按照美國(guó)食品藥品管理局(FDA)2000

17、年頒布的食品安全性評(píng)價(jià)毒理學(xué)原則，參照我國(guó)農(nóng)業(yè)部(MOA)頒布的《新獸藥一般毒性試驗(yàn)技術(shù)要求》和《新獸藥特殊毒性試驗(yàn)技術(shù)要求》進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并按照衛(wèi)生部(MOH)頒布食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法，獸藥注冊(cè)國(guó)際協(xié)調(diào)局(VICH)的新獸藥安全性評(píng)價(jià)要求進(jìn)行規(guī)范和完善。在對(duì)喹烯酮的急性毒性、亞慢性毒性、致突變性、致畸性、繁殖毒性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，并與同類藥物喹乙醇進(jìn)行比較。本研究結(jié)果與相關(guān)研究基本一致，喹烯酮的毒性很低，明顯弱于喹乙醇，其最高