大鼠缺血性腦損傷相關微小RNA的篩選研究.pdf

1、目的:
　　在細胞水平建立胎鼠神經(jīng)元氧/葡萄糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，通過微小RNA（microRNAs，miRNA）表達譜芯片篩選出與胎鼠神經(jīng)元OGD模型相關的miRNA。構建大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，驗證大鼠腦梗死組織中差異表達的miRNA，從而為探索miRNA是否參與及如何參與缺血性腦損傷提供理論基礎

2、，并進一步為臨床缺血性卒中的治療提供新的依據(jù)。
　　方法與結果:
　　一、SD大鼠胎鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)、OGD模型建立及miRNA篩選研究
　　孕17-18d SD大鼠麻醉剖腹取出胎鼠，在無菌條件下斷頭取腦，分離出大腦皮層，將皮層組織剪碎，0.125％胰蛋白酶消化15-17min，完全培養(yǎng)基終止消化;離心、取沉淀，吹打成細胞懸液，400目鋼紗過濾，按照每孔7×105個細胞種植到多聚賴氨酸包被的6孔板中;37℃5％CO2培

3、養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天半量換液一次。將培養(yǎng)第9d的神經(jīng)細胞隨機分為兩組:對照組和OGD組，OGD組培養(yǎng)液全量換為不含糖的DMEM培養(yǎng)基，使用95％N2+5％CO2混合氣體進行OGD損傷，半小時后更換成正常培養(yǎng)基，37℃5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)24h。對照組不處理繼續(xù)培養(yǎng)24h。抽提對照組和OGD組神經(jīng)元RNA，進行miRNA表達譜芯片檢測。細胞培養(yǎng)顯示，神經(jīng)元接種4h時即基本貼壁，24h時細胞完全貼壁，形態(tài)呈圓形、橢圓形，胞體周

4、圍光暈明顯，突起進一步伸長，細胞之間連接少，第9d時神經(jīng)元突起增長增粗、分支少、胞體明顯增大。芯片結果顯示，有7個miRNA表達明顯下調(diào)，10個miRNA表達明顯上調(diào)。根據(jù)芯片結果，選擇5個差異表達的miRNA（上調(diào):miR-134-5p、miR-130a-5p;下調(diào):miR-29b-1-5p、miR-128-2-5p、miR-338-3p）進行下一步組織實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymer

5、ase chain reaction，qRT-PCR)驗證。
　　二、SD大鼠MCAO模型建立及相關miRNA的驗證研究
　　將26只體重200-240gSD大鼠分為三組:對照組(n=8)、假手術組(n=8)和MCAO組(n=10)。MCAO組大鼠麻醉后固定，取頸正中切口，精細分離出左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，動脈夾夾閉頸總動脈、頸內(nèi)動脈，結扎頸外動脈，在頸外動脈近心端剪一小口，將提前準備好的線栓穿入頸總動脈分叉處，進

6、入頸內(nèi)動脈，至大腦中動脈開口處，進線長度約18mm，缺血2h后拔出線栓，恢復頸總和頸內(nèi)動脈供血，縫合皮膚。假手術組大鼠除不閉塞血管其余步驟與MCAO組一致，對照組不予任何處理。待再灌注24h后取腦行TTC染色。取三組大鼠腦組織，對照組和假手術組取梗死同側(cè)大腦皮層組織，MCAO組取梗死側(cè)及對側(cè)大腦皮層組織，抽提組織RNA，進行qRT-PCR驗證。結果顯示:第一，線栓法建立MCAO模型成功;第二，qRT-PCR組織驗證的5個miRNA，mi

7、R-134-5p、miR-130a-5p在梗死腦組織中表達明顯上調(diào)，miR-29b-1-5p、miR-128-2-5p、miR-338-3p在梗死組織中明顯下調(diào)，結果與芯片基本一致。
　　結論:
　　通過胎鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)及成功建立神經(jīng)元OGD模型，應用miRNA芯片技術，篩選出大鼠皮層神經(jīng)元OGD損傷后差異性表達明顯的17個miRNA，其中10個miRNA上調(diào)，7個miRNA下調(diào)。
　　通過線栓栓塞法成功建立大鼠MC