棉花1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶（GhACS1）基因的克隆及功能分析.pdf

1、乙烯作為一種重要的內(nèi)源信號(hào)分子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起了重要作用，它不僅能強(qiáng)烈影響種子的萌發(fā)、根毛的生長(zhǎng)、花的衰老、脫落以及果實(shí)的成熟(Johnson and Ecker，1998)，而且還能響應(yīng)于各種的生物或非生物脅迫，如病原菌入侵、傷害、冷害、臭氧、Li+等。高等植物乙烯的生物合成過(guò)程中由S-腺苷蛋氨酸合成ACC(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸)的反應(yīng)被認(rèn)為是關(guān)鍵步驟，催化此反應(yīng)的ACC合成酶(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶)就成為乙烯

2、合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。 近年來(lái)許多的ACC合成酶基因(ACS)不斷從不同植物中克隆出來(lái)，其表達(dá)模式也得到了廣泛的研究，而且利用轉(zhuǎn)基因的方法獲得的反義植株表現(xiàn)出明顯的抑制乙烯合成的特性。棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，近年來(lái)利用基因工程方法培育棉花新品種已經(jīng)成為棉花育種的研究熱點(diǎn)。本文以魯棉22為材料，首次從棉花中克隆了ACS基因(GhACS1)，并對(duì)其進(jìn)行了序列比對(duì)，表達(dá)特性分析及功能鑒定。具體結(jié)果如下： 1、本研究從棉花中首次

3、分離得到一個(gè)傷害誘導(dǎo)的ACS基因，即GhACS1，GenBank注冊(cè)號(hào)為DQ355792。其全長(zhǎng)1802bp，有一個(gè)1428bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)476氨基酸的多肽。序列分析發(fā)現(xiàn)GhACS1具有植物ACS基因的典型特征，有7個(gè)高度保守區(qū)、11個(gè)不變殘基和活性中心。該基因與來(lái)自柑橘、煙草、馬鈴薯、大豆、綠豆、擬南芥的ACS基因有較高的同源性。GhACS1與一些傷害誘導(dǎo)的基因如CsACS1、CsACS2、NtACS2、GmAC

4、S1和LeACS2在進(jìn)化上顯示出更進(jìn)的親緣關(guān)系。 2、Southern雜交結(jié)果表明在棉花基因組中可能存在多個(gè)與GhACS1具有一定同源性的其他ACS基因，或者說(shuō)棉花中的ACS是由一個(gè)多基因家族所編碼的。比較GhACS1 cDNA序列與其基因組序列，發(fā)現(xiàn)GhACS1基因組序列內(nèi)存在兩個(gè)內(nèi)含子，且這兩個(gè)內(nèi)含子都靠近該基因的5'端，這與植物ACS基因組中內(nèi)含子位置保守的特性一致。 3、半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)GhACS1是一

5、個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)的基因，可被傷害、ABA和Cu2+誘導(dǎo)而短暫表達(dá)，真菌、冷害、IAA、LiCl、NaCl不能誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，表明該基因不是一個(gè)多反應(yīng)基因，它只能被一些的外界脅迫所誘導(dǎo)，可能參與了某些脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中乙烯的合成。 4、構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-GhACS1，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，檢測(cè)到微弱的表達(dá)條帶，推測(cè)可能與該基因在植物組織內(nèi)短暫表達(dá)的特性有關(guān)。 5、將GhACS1構(gòu)建了正義植物表達(dá)載體p