2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、鈣離子是一種細(xì)胞內(nèi)重要的電荷載流子,同時(shí)作為一種普遍的介質(zhì)參與各種細(xì)胞過程。在心肌細(xì)胞里,這些過程包括基因轉(zhuǎn)錄、興奮-收縮耦聯(lián)及凋亡。眾所周知,細(xì)胞內(nèi)鈣離子傳遞電信號(hào)到機(jī)械活動(dòng),造成單個(gè)心肌細(xì)胞的短縮進(jìn)而整個(gè)心臟的收縮。然而,近期的研究結(jié)果越來越多的證據(jù)顯示細(xì)胞內(nèi)鈣超載會(huì)導(dǎo)致許多心臟疾病,如心肌病、心功能不全和心律失常。
  鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它可以磷酸化細(xì)胞內(nèi)的許多種蛋白,從

2、而使得細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度提高。CaMKII在正常的心肌細(xì)胞以及病理狀態(tài)下的心肌細(xì)胞里的鈣循環(huán)都起著重要的調(diào)控作用。而且,近期證實(shí),CaMKII有可能成為一個(gè)針對心臟疾病治療的潛在藥物靶標(biāo)。許多報(bào)道證實(shí)在心肌肥厚、心力衰竭和心律失常的病例中,CaMKII的活性增加、表達(dá)上調(diào)。在心臟疾病中,CaMKII蛋白的含量和活性程度會(huì)隨著離子通道的高表達(dá)而得到激活和提高。CaMKII有四種亞型α、β、γ及δ,其中δ亞型是CaMKII在心臟最主要的表型

3、。
  心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位有一個(gè)獨(dú)特的以平臺(tái)期為特征的延長的除極電位,它的形成主要是鈣離子內(nèi)流與鉀離子外流動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果。在很多心臟疾病中心肌細(xì)胞的電活動(dòng)的改變是由于鈣信號(hào)蛋白的重塑和其它離子通道蛋白的改變而發(fā)生的。CaMKII是一種廣為人知的調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子遷移的頻率和幅度的蛋白激酶,能被細(xì)胞CaMKII內(nèi)較高濃度的鈣離子激活,比如當(dāng)心率加快時(shí),細(xì)胞內(nèi)鈣增加,激活CaMKII,活化后的CaMKII可以磷酸化許多種絲氨酸/蘇氨酸鈣

4、調(diào)控蛋白,諸如L型鈣離子通道(LTCC)、軟諾丁受體(RyR2)、基質(zhì)網(wǎng)鈣離子受體2a抑制蛋白(PLN)。心肌細(xì)胞內(nèi)CaMKII通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度而改變動(dòng)作電位的時(shí)程,因此,CaMKII被認(rèn)為可能與增加心律失常的發(fā)生機(jī)會(huì)有關(guān)。但其中的機(jī)制還在不斷探求中。
  心房纖顫(房顫)是一種臨床上最為常見的心律失常,它的發(fā)生伴隨著血栓栓塞事件的增加和住院率的增加等危害,具有較多的致死率和致殘率。心房纖顫發(fā)生的潛在電生理機(jī)制是快速的異位

5、觸發(fā)心律和折返機(jī)制,而究其發(fā)生主要是由于延長的動(dòng)作電位時(shí)程及決定于心肌細(xì)胞減慢的電傳導(dǎo)和/或縮短的心房肌細(xì)胞不應(yīng)期。臨床上,在心房纖顫的患者的心房肌細(xì)胞里,發(fā)現(xiàn)存在有異常增高的細(xì)胞內(nèi)鈣蓄積,并且研究證實(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載,在心律失常的發(fā)生中起著關(guān)鍵的作用。同時(shí),在房顫患者的心房肌細(xì)胞里也發(fā)現(xiàn)有CaMKII的異常高表達(dá)。最近,更多的研究者在關(guān)注CaMKII與各種心律失常的聯(lián)系機(jī)制,但更多的試驗(yàn)正在涉及到確認(rèn)是否心房纖顫的發(fā)生及維持與CaMK

6、II直接相關(guān)。
  給予培養(yǎng)的原代心房肌細(xì)胞以快速的電場刺激,被用來模擬在體外心房纖顫的細(xì)胞微環(huán)境,且電場刺激被證實(shí)通過縮短動(dòng)作電位時(shí)程致易于發(fā)生房顫使得心房肌發(fā)生電重構(gòu)。但在這一過程中CaMKII的功能及作用還未被明確。我們設(shè)想增加心房肌細(xì)胞內(nèi)CaMKIIδ的表達(dá)量會(huì)影響到基質(zhì)網(wǎng)的鈣釋放以及L型鈣通道鈣離子內(nèi)流,而快速的電場刺激模擬增加的心率致細(xì)胞內(nèi)鈣短暫增加而激活CaMKIIδ,從而改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài),致房顫的發(fā)生。

7、  本研究通過改變CaMKIIδ表達(dá)量來探索其在電場刺激導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣變化中的作用,可以為房顫的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。
  實(shí)驗(yàn)方法:
  病毒載體構(gòu)建和病毒制備:大鼠CaMKIIδ(NM_012519)的cDNA從Open Biosystems購買(7939424)。開放閱讀框通過PCR的方法連接到慢病毒載體LV-IRES-RFP中,得到質(zhì)粒LV-CaMKIIδ-IRES-RFP. CaMKIIδ通過CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)

8、。為了下調(diào)CaMKIIδ表達(dá),我們設(shè)計(jì)了三對siRNA,并且連入慢病毒載體,此載體中siRNA通過雙向啟動(dòng)子表達(dá)。所有質(zhì)粒都通過測序驗(yàn)證。慢病毒顆粒通過將包裝質(zhì)粒和病毒載體共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞獲得,粗制的病毒液收集后超速離心可獲得滴度108 TU/ml的病毒液,用于后繼實(shí)驗(yàn)。
  原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:從新生大鼠(1-2天)上快速分離心臟,再將心室分離并用0.125%胰酶和0.1%膠原酶I消化。收集單細(xì)胞懸液,按0.5~1×10

9、4/cm2的密度接種于6孔板或玻片上.48小時(shí)后,按MOI=10加入慢病毒。培養(yǎng)48小時(shí)后,將培養(yǎng)基換為新鮮DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞待后繼使用。
  心肌細(xì)胞電場刺激:培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi),加上連續(xù)電場刺激24小時(shí)。電場由計(jì)算機(jī)控制,電波頻率10Hz,電壓1.5 V/cm。
  細(xì)胞鈣檢測:咖啡因刺激的鈣流通過掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。L型鈣離子通道電流通過膜片鉗檢測。挑選帶有紅色熒光的心肌細(xì)胞進(jìn)行檢測。為了消除細(xì)胞

10、大小差異的影響,電流強(qiáng)度定義為電流密度除以細(xì)胞電容。
  結(jié)果:
  成功構(gòu)建了CaMKIIδ基因的表達(dá)慢病毒載體,通過轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞制備慢病毒,可以得到高滴度的病毒液,用此病毒轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞,能夠在細(xì)胞內(nèi)獲得較好的基因表達(dá)。另一方面設(shè)計(jì)了三條干擾序列,通過轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞并用Western blot檢測篩選出2#序列具有較好的干擾效率,將此序列構(gòu)建到慢病毒載體中獲得了干擾CaMKIIδ的病毒載體。
  成功從

11、新生大鼠心臟分離培養(yǎng)出原代心肌細(xì)胞,并通過免疫組化和免疫熒光鑒定培養(yǎng)的心肌細(xì)胞純度可達(dá)到90%以上。將制備的慢病毒濃縮到108 TU/ml以上,按MOI=10轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞,通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測感染率可以達(dá)到70%。而進(jìn)一步通過western blot和qPCR檢測過表達(dá)及干擾病毒的效果,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞CaMKIIδ表達(dá)為對照病毒的兩倍,而干擾病毒轉(zhuǎn)染后,CaMKIIδ表達(dá)約為對照病毒的50%。從而成功的在原代細(xì)胞

12、中獲得了CaMKIIδ的過表達(dá)和干擾。
  對原代心肌細(xì)胞進(jìn)行電場刺激后檢測CaMKIIδ變化,發(fā)現(xiàn)CaMKIIδ的活性增加,但是表達(dá)量未發(fā)生變化。進(jìn)一步檢測過表達(dá)和干擾CaMKIIδ的細(xì)胞,其表達(dá)量在電場刺激前后均未發(fā)生變化。在未刺激情況下,CaMKIIδ的表達(dá)變化會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放和L型鈣流的變化。高表達(dá)細(xì)胞中,L鈣流增加了約25%;而低表達(dá)細(xì)胞中,其下降了約28%。在電場刺激情況下,CaMKIIδ表達(dá)依然導(dǎo)致了胞內(nèi)鈣的變化。

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