不同1p雜合性缺失特征少枝膠質(zhì)瘤的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤,發(fā)病率高,但治愈率低。盡管外科新技術(shù)的發(fā)展以及化療、放療的廣泛應(yīng)用使得膠質(zhì)瘤的預(yù)后有所改善,但是大多數(shù)膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍然較差。少枝膠質(zhì)瘤(Oligodendroglioma,OG)是膠質(zhì)瘤的主要類型之一,占膠質(zhì)瘤的4-15％,占所有原發(fā)腦腫瘤的2-5％,由于近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其對(duì)化療較為敏感、預(yù)后較好而成為膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)。近期研究發(fā)現(xiàn)這些對(duì)化療敏感的少枝膠質(zhì)瘤大都有1p/19q的雜合性缺失(Loss of hetero

2、zygosity,LOH)。進(jìn)一步的研究顯示具有不同1p/19qLOH(或1pLOH)特征的這兩類腫瘤在很多方面還有差異,如好發(fā)部位、腫瘤對(duì)放療的敏感性及最終的預(yù)后等等。這些都說(shuō)明在光鏡下無(wú)法區(qū)分的這兩種腫瘤可能是兩類分子生物學(xué)特征不同的腫瘤,對(duì)它們的分型可能有助于臨床的治療和預(yù)后的判斷。但是目前除了1p/19q染色體的差異以外,人們對(duì)這兩類腫瘤的其它差異如基因表達(dá)、蛋白差異乃至最終的分子生物學(xué)機(jī)制仍然知之不多,所以有必要對(duì)此進(jìn)一步的研

3、究。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)分析是一個(gè)能同時(shí)研究大量蛋白質(zhì)及其表達(dá)變化的方法,正逐漸應(yīng)用于從基礎(chǔ)科學(xué)到臨床實(shí)踐科學(xué)的廣泛領(lǐng)域中,受到前所未有的重視。在人類基因組計(jì)劃的推動(dòng)下,人們從基因水平對(duì)腫瘤進(jìn)行了廣泛的研究,并且發(fā)現(xiàn)了許多與腫瘤相關(guān)的基因,包括一些與腫瘤治病有關(guān)的致癌基因和抑癌基因,但基因的功能活動(dòng)最終要靠蛋白質(zhì)來(lái)體現(xiàn)。眾所周知,從DNA-mRNA-蛋白質(zhì)的過(guò)程中存在著轉(zhuǎn)錄后剪切和翻譯后的修飾加工,以及蛋白質(zhì)合成后的轉(zhuǎn)移定位等多種變化

4、,所以DNA和mRNA的水平和狀況并不完全代表蛋白質(zhì)的水平和狀況。而以往的蛋白質(zhì)研究方法如Western blot等一次只能對(duì)一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行研究。但我們現(xiàn)在知道腫瘤的分子生物學(xué)機(jī)制都是涉及成百上千個(gè)蛋白活動(dòng)的過(guò)程,因此,有必要從蛋白質(zhì)整體水平來(lái)研究、尋找出與腫瘤相關(guān)的特征蛋白質(zhì),闡明其機(jī)制。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAO)技術(shù)是近年來(lái)新開(kāi)發(fā)的一種蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究技術(shù),具有較好的定量效果、較高的重復(fù)性,并可對(duì)多達(dá)8種不

5、同樣本同時(shí)進(jìn)行定量分析。因此,ITRAQ標(biāo)記一串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)是尋找疾病和腫瘤發(fā)生過(guò)程中的標(biāo)志性蛋白或者稱為Biomarker的理想方法。我們此次使用iTRAQ技術(shù)結(jié)合多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2D-LCMS/MS)對(duì)不同1pLOH特征的少枝膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組分析,尋找特異蛋白作為診斷標(biāo)志并進(jìn)一步探求不同少枝膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制。
　　第一部分熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)少枝膠質(zhì)瘤1p染色體的雜合性缺失
　　目的:研究少枝膠質(zhì)瘤中1

6、p染色體的雜合性缺失。
　　方法:使用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)16例少枝膠質(zhì)瘤標(biāo)本及5例正常對(duì)照腦組織行1p染色體檢測(cè)。
　　結(jié)果:在16例少枝膠質(zhì)瘤中有10例有1p染色體的雜合性缺失,占62.5％,其中6例Ⅱ級(jí)腫瘤中有5例缺失,10例Ⅲ級(jí)腫瘤中有5例缺失。
　　結(jié)論:1p染色體雜合性缺失是少枝膠質(zhì)瘤的重要分子生物學(xué)特征,通過(guò)熒光原位雜交技術(shù),我們可以對(duì)這兩類少枝膠質(zhì)瘤有效地加以區(qū)分,并用于進(jìn)一步的臨床診斷和治療。
　

7、　第二部分基于iTRAQ技術(shù)的少枝膠質(zhì)瘤差異蛋白質(zhì)組分析
　　目的:對(duì)不同1pLOH特征的少枝膠質(zhì)瘤進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組分析,尋找特異蛋白用于診斷和治療。
　　方法:使用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)結(jié)合多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2D-LCMS/MS)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)8例不同1pLOH特征的兩組少枝膠質(zhì)瘤進(jìn)行分析,并用DAVID、KEGG軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理行生物信息學(xué)分析,通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析找出差異蛋白質(zhì)。
　　

8、結(jié)果:通過(guò)蛋白質(zhì)組分析在8例少枝膠質(zhì)瘤中共鑒定得到449個(gè)蛋白質(zhì),統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)HMGB1、MAP2、TMSB4X、LRPAP1、MARCKSL1、RPLP2、CISD1、ATP6V1E1、PSAP、PPIF、ARPC5L這11個(gè)蛋白在1pLOH的OG中表達(dá)較1p正常組腫瘤高,UBA1、PRKAR1A兩個(gè)蛋白在1p正常的OG中表達(dá)較1pLOH組腫瘤高。
　　結(jié)論:在兩組不同1pLOH特征的少枝膠質(zhì)瘤中找到多個(gè)有差異表達(dá)的蛋白質(zhì),較其

9、它蛋白質(zhì)組學(xué)方法找到的蛋白譜范圍更廣;生物信息學(xué)分析顯示Actin cytoskeleton通路的不同可能與這兩類腫瘤的不同機(jī)制有關(guān),HMGB1、UBA1可能與OG的化療敏感性有關(guān),MAP2可能與OG的預(yù)后有關(guān),ATP6V1E1可能與代謝酶的失調(diào)有關(guān)。
　　第三部分HMGB1、MAP2、UBA1、ATP6V1E1蛋白在不同1pLOH特征的少枝膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其意義
　　目的:驗(yàn)證HMGB1、MAP2、UBA1、ATP6V1E

10、1等差異蛋白在不同1pLOH特征的少枝膠質(zhì)瘤中的表達(dá)并分析其意義。
　　方法:使用Western blot對(duì)兩組腫瘤中的差異蛋白質(zhì)UBA1、ATP6V1E1進(jìn)行驗(yàn)證;并用免疫組化方法對(duì)UBA1、ATP6V1E1、MAP2、HMGBl在39例擴(kuò)大樣本中的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示UBA1在1p正常組OG中的表達(dá)量高于在1pLOH組中的表達(dá)量,ATP6V1E1在1pLOH組OG中的表達(dá)量高于1p正