促內(nèi)皮修復(fù)藥物洗脫支架的實驗研究.pdf

1、第一部分:殼聚糖/肝素層層自主裝涂層的生物相容性的實驗研究
　　目的:研究殼聚糖/肝素層層自組裝涂層對CD133+內(nèi)皮祖細胞的黏附、增殖相關(guān)基因表達的影響,并從分子生物學(xué)角度探討其作為促內(nèi)皮修復(fù)功能藥物沈脫支架涂層材料的可行性。
　　方法:1.分離人臍血單個核細胞,免疫磁珠分選CD133+內(nèi)皮祖細胞;2.制備殼聚糖/肝素層層自組裝涂層,1％明膠涂層以及玻璃對照皿,接種并培養(yǎng)分選所得內(nèi)皮祖細胞;3.免疫熒光鑒定內(nèi)皮祖細胞;4.

2、抽提總RNA,RT-PCR法比較不同培養(yǎng)介質(zhì)中細胞的Enos、VE-cadherin、KDR、PECAM-1、Sirtuin-1、Thrombomodulin等基因的表達差異。
　　結(jié)果:1.重力梯度離心及磁珠分選法所得CD133+內(nèi)皮祖細胞純度較高(92.88％±0.51％(n=4)),在VEGF誘導(dǎo)下能較好的分化為內(nèi)皮細胞;2.Enos、Ve-cadherin、KDR、PECAM-1和Sirtuin-1在殼聚糖/肝素層層自組裝

3、涂層組表達豐度較玻璃對照組顯著增高(P＜0.05),與明膠組差異不明顯,Thrombomodulin在殼聚糖涂層表達豐度較明膠組、玻璃組表達均增高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.重力梯度離心及磁珠分選法所得CD133+內(nèi)皮祖細胞純度較高(92.88％±0.51％(n=4)),在VEGF誘導(dǎo)下能較好的分化為內(nèi)皮細胞;2.Enos、Ve-cadherin、KDR、PFCAM-1和Sirtuin-1在殼聚糖/肝素層層自組裝涂層組表達豐

4、度較玻璃對照組顯著增高(P＜0.05),與明膠組差異不明顯,Thrombomodulin在殼聚糖涂層表達豐度較明膠組、玻璃組表達均增高(P＜0.05);3.殼聚糖涂層能促進內(nèi)皮祖細胞的黏附、增殖,生物相容性好,為理想的生物材料。
　　第二部分:殼聚糖/肝素層層自組裝(LBL)支架、LBL-Drug支架的制備及相關(guān)特性研究
　　目的:制備殼聚糖/肝素層層自組裝涂層支架(LBL),LBL-Drug支架,并對其機械性能、堅韌性、親

5、水性、藥物釋放特點、細胞黏附能力等理化性能做檢測。
　　方法:1.通過浸泡法制備LBL支架,噴涂法制備雷帕霉素藥物洗脫支架(Drug),非對稱涂層處理方法制備LBL-Drug支架;2.電鏡觀察支架壓握及擴張后變化,支架堅韌性實驗,測定所制備支架的接觸角,LBL-Drug支架的藥物體外釋放測試,以及體外模擬內(nèi)皮細胞黏附實驗,觀察支架的性能。
　　結(jié)果:1.成功制備了殼聚糖/肝素層層自組裝支架(LBL)、LBL-Drug支架,對

6、其物理性能及藥物釋放等特點進行檢測,其表征特點符合支架制作的工藝要求,壓握及擴張后涂層覆蓋均勻無開裂脫落,在干性濕性條件下擴張均無明顯差異,支架接觸角的檢測表明經(jīng)過層層自組裝技術(shù)處理后支架親水性增強,具有良好的生物相容性;2.LBL-Drug洗脫支架雷帕霉素釋放曲線呈爆發(fā)性釋放的特點,與目前上市的雷帕霉素藥物洗脫支架的釋放特點一致;3.體外模擬細胞黏附試驗可以得出經(jīng)LBL處理的支架細胞黏附能力增強,支架涂層材料具有良好的生物相容性。

7、r>　　結(jié)論:1.上述支架制備工藝符合植入性冠脈支架的基本要求;2.經(jīng)LBL處理的支架其親水性增強,生物相容性增N;3.經(jīng)LBL處理的支架能促進細胞黏附的能力,可以促進早期內(nèi)皮修復(fù)。
　　第三部分:動物實驗評價促內(nèi)皮修復(fù)藥物洗脫支架的有效性和安全性
　　目的:小型豬動物模型中觀察促內(nèi)皮修復(fù)藥物洗脫支架(LBL-Drug支架)的有效性和安全性。
　　方法:1.將BMS及第二部分所制備的LBL、Drug、LBL-Drug支

8、架隨機植入小型豬的前降支、回旋支和右冠狀動脈,通過過度擴張形成冠脈損傷模型。術(shù)后1周,1月,3月,6月時,觀察支架內(nèi)皮覆蓋情況、內(nèi)膜增生情況、植入部位炎癥;2.6月時血管內(nèi)超聲評價內(nèi)膜增生情況;3.1、3、6月隨訪冠脈造影時經(jīng)冠脈注入乙酰膽堿,觀察內(nèi)皮依賴的血管收縮反應(yīng),了解內(nèi)皮功能。
　　結(jié)果:1.各組支架內(nèi)皮覆蓋速度具有差異,其中LBL和LBL-Drug組覆蓋速度較快,在植入1周后即開始有部分內(nèi)皮覆蓋,其速度快于BMS組,而單

9、純Drug組支架的內(nèi)皮覆蓋率最慢,1月時四組內(nèi)皮均覆蓋完整,至6月時,四組內(nèi)皮覆蓋完好,其中LBL和LBL-Drug組較BMS組及Drug組比較,內(nèi)皮相對光滑,連接緊密,BMS組出現(xiàn)內(nèi)膜增殖導(dǎo)致管腔狹窄;2.通過病理切片觀察及計算機輔助測量,Drug-LBL組和Drug組管腔面積在1月、3月、6月時與其他兩組低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而BMS組和LBL組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);Drug-LBL組和Drug組的新生

10、內(nèi)膜面積和新生內(nèi)膜厚度在1月、3月、6月時比其他兩組低,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),BMS組和LBL組間差異不明顯(P＞0.05);LBL-Drug組和Drug組狹窄率在1月、3月、6月時比其他兩組低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),BMS組最高。3.從炎癥細胞浸潤上看,1月時Drug支架炎癥浸潤最嚴(yán)重,炎癥積分高,各組1月時的炎癥積分分別為:BMS0.71±0.69,LBL0.5±0.5,Drug1.71±0.69,LBL-

11、Drug0.71±0.69。Drug炎癥積分較其他三組高,其差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),BMS,LBL及LBL-Drug組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),3月及6月時炎癥細胞浸潤較1月時減輕,各支架組的炎癥積分差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);4.6月時IVUS檢查見BMS組支架內(nèi)明顯內(nèi)膜增生,管腔狹窄率60％左右,LBL組支架內(nèi)僅輕度內(nèi)膜增生,Drug支架組和LBL-Drug支架組,未見明顯內(nèi)膜增生;5.乙酰膽堿觀察內(nèi)皮依賴

12、的血管收縮試驗可以得出,3個月時受乙酰膽堿最明顯,而6個月時則開始恢復(fù)。Drug組支架對于內(nèi)皮功能的影響最大且持續(xù)時問最長,而帶有LBL涂層的支架則受內(nèi)皮功能的影響相對小,且在3個月時開始恢復(fù),6個月時基本恢復(fù)到安裝支架時的水平。LBL支架對內(nèi)皮功能的影響較Drug支架小,且內(nèi)皮功能恢復(fù)早。
　　結(jié)論:1.所制備的四組支架在小型豬冠狀動脈植入的模型是可行的,通過1-6個月的隨訪可以評價其安全性及有效性。2.LBL-Drug組和Dr

13、ug組在1月,3月,6月時其管腔面積大于BMS組和LBL組,狹窄率低于BMS組和LBL組,新生內(nèi)膜面積和新生內(nèi)膜厚度低于BMS和LBL組。Drug組在植入1月后炎癥反應(yīng)最大。LBL-Drug支架在植入6月后內(nèi)膜覆蓋完整規(guī)則,無支架內(nèi)狹窄,支架周圍炎癥反應(yīng)低,結(jié)果理想。3.采用非對稱涂層技術(shù)(LBL-Drug支架),支架內(nèi)層單純涂層LBL促進內(nèi)皮細胞修復(fù),支架外層采用可降解材料及抗增殖藥物,在抑制平滑肌細胞增殖同時促進內(nèi)皮快速覆蓋,使支架