齊口裂腹魚MHCⅡA基因的克隆、組織分布及其在胚胎和仔魚中表達(dá)的初步研究.pdf

1、本文以齊口裂腹魚為研究對象，克隆其MHCⅡ A基因，初步探究該基因的分子多態(tài)性、組織表達(dá)的特異性以及在胚胎和仔魚中的差異性表達(dá)模式，以期為齊口裂腹魚的抗病育種研究提供一定的理論基礎(chǔ)。主要組織相容性復(fù)合體(Major HistocompatibilityComplex，MHC)的Ⅱ類分子是脊椎動物中一種編碼細(xì)胞表面糖蛋白，具有高度多態(tài)性的基因，且部分基因型與機(jī)體抗病力存在較強(qiáng)的相關(guān)性。本研究首先利用同源克隆和RACE技術(shù)獲得齊口裂腹魚MH

2、CⅡA基因的cDNA全序列，其次借助測序法分析了該基因的開放閱讀框（ORF區(qū)）的多態(tài)性，最后運(yùn)用實時熒光定量PCR檢測其組織分布以及在同一親本的胚胎和仔魚中表達(dá)情況。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)齊口裂腹魚MHCⅡA基因的cDNA序列全長為909bp(Genebank登陸號:KM670437)，其中5'-UTR為64bp，ORF區(qū)為711bp，3'-UTR為135bp，并含有典型聚腺苷酸化信號（AATAAA）和27個Poly(A)

3、。編碼蛋白含有236個氨基酸，其推測的蛋白質(zhì)分子量為25.94Kda，理論等電點為pI=4.60。其預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)同其它物種具有典型的MHCⅡA的結(jié)構(gòu)特征，包含1個信號肽、2個胞外結(jié)構(gòu)域(α-1和α-2)、1個跨膜區(qū)和1個胞質(zhì)區(qū)。編碼蛋白的氨基酸序列存在4個保守的半胱氨酸殘基、經(jīng)典的氨基酸框架結(jié)構(gòu)GXXXGXXGXXXG以及豐富的磷酸化位點，且與建鯉（Cyprinus carpiovar Jian）同源性最高，相似度為83.03％。

4、r>　　(2)從8尾健康成魚中得到17條不同的MHCⅡA基因的cDNA序列，其中最多1尾獲得4條不同序列。分析表明該基因至少編碼15條不同的氨基酸序列，至少含有2個基因座。其中1條氨基酸序列與其它14條的同源性為89.6％～94.2％，序列間的差異介于5.8％～10.4％之間。同時在編碼的氨基酸殘基中共發(fā)現(xiàn)50個變異位點，其中35個變異位點主要集中于α-1區(qū)，占變異位點總數(shù)的70％，表明該基因具有高度的多態(tài)性。
　　(3) MHC

5、Ⅱ A基因在所檢測成魚的19個不同臟器組織中均有分布，但表達(dá)量差異顯著，體現(xiàn)出表達(dá)的組織特異性。中腎、頭腎、中腸、前腸、后腸、脾臟、紅肌和心臟中的表達(dá)量較高，腦、卵巢、肝胰臟、鰭條、白肌中的表達(dá)量次之。該基因在中腎中檢測到最高的表達(dá)水平，其是血液的15.869倍(P＜0.05)。血液、眼睛、精巢、皮膚、鰓和鰾的表達(dá)量較低，其中表達(dá)量最低的鰾只占血液的38.5％(P＜0.05)。分析表明該基因的表達(dá)水平與免疫相關(guān)的器官或組織緊密關(guān)聯(lián)。

6、r>　　(4)通過檢測28個時期的胚胎發(fā)現(xiàn)，未受精卵、受精到原腸期的胚胎中均檢測到MHCⅡ A基因表達(dá)。但受精1h到8細(xì)胞期的胚胎表達(dá)量都低于未受精卵，表明該基因在齊口裂腹魚早期胚胎中的表達(dá)水平主要受到母源因子mRNA控制。并且該基因在16細(xì)胞期胚胎中表達(dá)量達(dá)到峰值，是未受精卵的2.259倍(P＜0.05)，表明其表達(dá)水平主要受到合子基因的控制。而胚胎進(jìn)入囊胚期后，該基因表達(dá)量顯著性的降低，僅為未受精卵的8.6％(P＜0.05)，尤其是

7、器官形成階段的胚胎中幾乎檢測不到該基因的表達(dá)，表明此發(fā)育階段的胚胎自身合成的MHCⅡA基因顯著性減少或沒有表達(dá)，可能是MHCⅡB基因表達(dá)量增加所致。
　　(5)通過檢測9個時期的仔魚發(fā)現(xiàn)，MHCⅡA基因在不同時期的仔魚中表達(dá)水平差異顯著。在剛出膜仔魚中的表達(dá)量只有未受精卵的2％(P＜0.05)。但在進(jìn)入眼球色素出現(xiàn)期和循環(huán)期的仔魚中，該基因的表達(dá)量顯著性的增加，分別是未受精卵的7.296和24.794倍(P＜0.05)。并且在消化