齊口裂腹魚MCH、CRH和GnRH2基因的克隆、組織分布及攝食功能研究.pdf

1、為研究黑色素聚集激素(melanin-concentrating hormone，MCH)、促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)和促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)基因在齊口裂腹魚攝食調控中發(fā)揮的作用，本試驗首先利用RT-PCR和RACE技術首次克隆了齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)MCH、CR

2、H和GnRH2的cDNA全序列;隨后運用熒光定量PCR技術對MCH、CRH和GnRH2在不同組織的分布進行了檢測;最后研究在不同攝食狀態(tài)下MCH、CRH和GnRH2 mRNA在下丘腦表達的影響變化。
　　研究結果表明:齊口裂腹魚MCH eDNA全長序列為589bp，其中5'非編碼區(qū)(5'-UTR)66 bp，3'非編碼區(qū)(3'-UTR)148 bp，開放閱讀框(ORF)375 bp，編碼124個氨基酸包括N末端24個氨基酸的信號肽

3、、C末端17個氨基酸的成熟肽和13個氨基酸的神經(jīng)肽Mgrp，與金魚(Carassius auratus)的MCH的序列同源性最高，相似性可達到90.3％;齊口裂腹魚CRH cDNA全長序列的長度為1046 bp，其中5'-UTR為127bp，3'-UTR為430bp，ORF為489 bp，編碼162個氨基酸包括24個氨基酸的信號肽、41個氨基酸的成熟肽和11個氨基酸的保守區(qū)域，與鯉科魚類特別是鯉魚(Cyprinus carpio) CR

4、H氨基酸序列一致性最高為96.3％;齊口裂腹魚GnRH2 cDNA全長序列的長度為693 bp，其中5'-UTR為160bp，3'-UTR為272bp，ORF為261 bp，編碼86個氨基酸包括24個氨基酸的信號肽、10個氨基酸的成熟肽和49個氨基酸的GnRH相關肽，其氨基酸序列與鯉魚，稀有鮈鯽（Gobiocyprisrarus）和斑馬魚(Danio rerio)的GnRH2具有很高的一致性分別為98.6％、95.9％、90.5％。

5、r>　　利用qPCR對齊口裂腹魚MCH、CRH和GnRH2 mRNA在不同組織的表達進行檢測，結果顯示:MCH、CRH和GnRH2 mRNA在腦部的表達量最高。MCH mRNA主要在大腦和垂體分布，而在其他外周組織幾乎沒有表達。進一步對腦部區(qū)域檢測發(fā)現(xiàn)，MCH mRNA在下丘腦的表達最高，而在其他腦區(qū)域的表達都很低。CRHmRNA在外周組織中廣泛表達，進一步研究CRH在腦部不同區(qū)域的表達的發(fā)現(xiàn)，除了小腦中幾乎沒有檢測到CRH mRNA表

6、達外，在其他區(qū)域均有表達且下丘腦的表達量最高。GnRH2 mRNA在所檢測的組織中都有表達，進一步研究GnRH2在腦部不同區(qū)域的表達的發(fā)現(xiàn)，GnRH2 mRNA在腦部的不同區(qū)域都有表達，表達最高的是在下丘腦。
　　在餐前餐后的試驗中設置7個處理組，且每個處理組放養(yǎng)15尾魚（體重為39.42±3.61g），將11:00作為0時每天進行喂食。喂養(yǎng)兩周后，在喂食前3小時(8:00)，喂食前1小時(10:00)，喂食時(11:00)，喂食

7、后1小時(12:00)和喂食后3小時(14:00)取下丘腦進行試驗，其中有兩個組在0時不喂食作為禁食組。結果顯示:在餐后的1小時和3小時喂食組與對禁食組相比，下丘腦MCH mRNA表達量顯著下降(P＜0.05); CRH mRNA表達量沒有顯著差異(P＞0.05);GnRH2 mRNA表達量在餐后1小時和3小時都顯著增加(P＜0.05)。
　　長期禁食試驗中設置喂食組和禁食組各3個重復，每個重復各20尾魚(體重為36.75±4.1

8、2g)，喂食組正常喂食，禁食組禁食7天，第9天按之前喂食方法進行復投喂直到14天。結果顯示:在第1，3，5和7天時，禁食組與對照組相比，下丘腦MCH mRNA的表達量顯著增加(P＜0.05)，而第9天復投喂組的MCH mRNA水平顯著下降，到第14天時與喂食組相比沒有顯著差異（P＞0.05）;在禁食的第7天，禁食組與對照組相比下丘腦CRH mRNA內(nèi)的表達量顯著降低（P＜0.05），復投喂組的CRH mRNA水平與喂食組相比有顯著增加（

9、P＜0.05），到第14天時，復投喂組CRH mRNA表達水平與喂食組一致;在禁食1，3，5和7天，禁食組與對照組相比下丘腦GnRH2 mRNA內(nèi)的表達量顯著降低（P＜0.05），第9天復投喂后，復投喂組的GnRH2 mRNA水平顯著升高，到第14天與喂食組相比無顯著差異（P＞0.05）。
　　結論:1、在齊口裂腹魚上首次克隆出了MCH、CRH和GnRH2基因的全長序列;2、MCH、CRH和GnRH2在大腦中表達量最高;3、不同的