腫瘤來源自噬小體(DRibbles)活化B細(xì)胞及其功能的研究.pdf

1、自噬(autophagy)是細(xì)胞利用溶酶體降解胞漿中受損或廢棄的細(xì)胞器及不再需要的大分子物質(zhì)的過程。自噬過程中形成的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡稱為自噬小體(autophagosome)。自噬對細(xì)胞的能量循環(huán)、代謝、細(xì)胞器的更新及維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有非常重要的作用。研究表明，許多腫瘤細(xì)胞都存在自噬活性的改變，細(xì)胞自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療之間存在著重要的相關(guān)性。通過誘導(dǎo)自噬及抑制溶酶體/蛋白酶體的活性，細(xì)胞內(nèi)大量的長壽蛋白、短壽蛋白、核糖體錯(cuò)誤編碼的

2、產(chǎn)物(DRiPs)包裹在自噬小體中。這種的自噬小體被稱為DRibbles(DRiPs-containing blebs)。研究發(fā)現(xiàn)，DRibbles中包含了多種損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)分子，包括熱休克蛋白(HSPs)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)以及高遷移率族蛋白1(HMGB1)等。DRibbles中包含的這些的模式分子可以作為天然佐劑在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。已經(jīng)證明，DRibbles是“交叉遞呈”腫瘤抗原的有效載體

3、，樹突細(xì)胞(DCs)能通過細(xì)胞質(zhì)膜微囊及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的方式將DRibbles中所含的腫瘤抗原交叉遞呈給T細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。
　　B細(xì)胞最重要的功能是分化為漿細(xì)胞分泌抗體并介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答?？贵w通過誘導(dǎo)保護(hù)性的抗體應(yīng)答可作為機(jī)體抗感染的第一道屏障。B細(xì)胞能通過BCR特異性的識別可溶性抗原和細(xì)胞膜相關(guān)抗原，并產(chǎn)生應(yīng)答。新近研究證明，B細(xì)胞表達(dá)幾乎所有亞型的TLRs，能夠識別病原相關(guān)的分子模式(PAMPs)，在B細(xì)胞增殖、分

4、化、細(xì)胞因子和抗體分泌等方面起調(diào)節(jié)作用，被稱為B細(xì)胞活化的第三信號。B細(xì)胞除了可在體液免疫中發(fā)揮重要作用外，還可以作為專職的抗原遞呈細(xì)胞，在特定條件下可以有效地交叉遞呈抗原。然而，靜息的B細(xì)胞不能激活初始T細(xì)胞(Na(i)ve T cells)，反而會使它失活。有研究采用脂多糖(LPS)等刺激活化B細(xì)胞可以上調(diào)B細(xì)胞表面MHCⅠ類、Ⅱ類分子以及共刺激分子CD80/86等，但依舊無法有效活化初始T細(xì)胞，尤其是初始CD8+T細(xì)胞。有研究證明

5、，聯(lián)合CD40分子（轉(zhuǎn)染CD40L的3T3細(xì)胞、可溶性的CD40L三聚體、抗CD40抗體等）、細(xì)胞因子IL-4及TLR激活劑(LPS、CpG等)，可在體外活化外周血來源的B細(xì)胞，上調(diào)其表面MHCⅠ類和Ⅱ類分子以及共刺激分子CD80/86的表達(dá)，誘導(dǎo)B細(xì)胞大量增殖。并且活化的B細(xì)胞負(fù)載抗原（腫瘤細(xì)胞裂解液、短肽、逆轉(zhuǎn)錄病毒/RNA轉(zhuǎn)染抗原或病毒抗原等）后，在體外能誘導(dǎo)抗原特異性的初始CD8+T細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。許多研究也證明，

6、活化的B細(xì)胞可以誘導(dǎo)抗原特異性的T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)而具有抗腫瘤效應(yīng)。我們的前期實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞自噬小體DRibbles能誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖、活化并分泌腫瘤抗原特異性抗體，但自噬小體活化B細(xì)胞的分子機(jī)制及其抗腫瘤作用尚不清楚。
　　目的:
　　研究腫瘤來源自噬小體(DRibbles)活化B細(xì)胞分子機(jī)制;研究B細(xì)胞交叉遞呈DRibbles抗原誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答及其抗腫瘤作用的效果及其免疫學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　1.用DRib

7、bles刺激野生型、TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-/-小鼠脾臟B細(xì)胞，檢測TLRs在DRibbles誘導(dǎo)的B細(xì)胞活化中的作用。DRibbles與小鼠脾臟B細(xì)胞孵育不同時(shí)間(0、20、40、60min)，western blot法分析NF-kB通路中I-kBα和IKKα/β的磷酸化水平，探討DRibbles活化小鼠B細(xì)胞的信號通路。采用HMGB1抗體封閉DRibbles中的HMGB1抗原表位，然后與磁珠分選的小鼠脾臟B細(xì)胞共

8、孵育，檢測B細(xì)胞MHCⅡ類分子與CD86的表達(dá)以及培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10和總IgM含量，探討HMGB1對DRibbles刺激B細(xì)胞活化的影響。采用FilipinⅢ封閉B細(xì)胞中caveolae介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞，然后與DRibbles共孵育，檢測caveolae介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞對DRibbles刺激B細(xì)胞活化的作用。
　　2.采用DRibbles(OVA+)免疫OT-1小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞作為效應(yīng)T細(xì)胞，體外與單獨(dú)DRibbles、單

9、獨(dú)B細(xì)胞、負(fù)載DRibbles或腫瘤細(xì)胞裂解液的小鼠B細(xì)胞共孵育5天，單獨(dú)的培養(yǎng)基和OT-1 peptide SIINFEKL分別作為陰性和陽性對照。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CFSE標(biāo)記的OT-1效應(yīng)T細(xì)胞的增殖。分選DRibbles免疫小鼠的效應(yīng)CD4+T和CD8+T細(xì)胞，與負(fù)載DRibbles的野生型、TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-/-小鼠B細(xì)胞分別孵育72h，ELISA及胞內(nèi)染色法檢測細(xì)胞分泌IFN-γ的含量;分選DRib

10、bles免疫小鼠的效應(yīng)CD4+T和CD8+T細(xì)胞，與負(fù)載αHMGB1封閉DRibbles的B細(xì)胞共孵育，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量，探討DRibbles抗原刺激效應(yīng) T細(xì)胞再活化的物質(zhì)基礎(chǔ);分選DRibbles免疫小鼠的效應(yīng)CD4+T和CD8+T細(xì)胞，與負(fù)載DRibbles的野生型及FilipinⅢ處理的B細(xì)胞分別孵育72h，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量，探討B(tài)細(xì)胞交叉遞呈DRibbles抗原、誘導(dǎo)

11、效應(yīng)T細(xì)胞再活化的分子機(jī)制。
　　3.皮下接種小鼠T淋巴瘤細(xì)胞—EG7構(gòu)建小鼠淋巴瘤模型，第7天采用淋巴結(jié)注射DRibbles(OVA+)作為首次免疫同時(shí)伴隨或不伴隨OT-1 T細(xì)胞的尾靜脈回輸，第10，14天以尾靜脈注射以CpG、抗CD40抗體預(yù)處理或不處理的B/DRibbles(OVA+)疫苗、DC/DRibbles方式進(jìn)行加強(qiáng)免疫，并以單獨(dú)B細(xì)胞及未免疫組作為對照，定期測量檢測實(shí)體瘤大小以觀察B/DRibbles疫苗在抗腫瘤

12、效應(yīng)中的作用;收獲上述小鼠的腫瘤組織、脾臟組織以及血清，采用流式細(xì)胞儀檢測腫瘤組織浸潤C(jī)D4+T和CD8+T細(xì)胞的比例、脾臟細(xì)胞中IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的比例;采用ELISA檢測血清中抗EG7腫瘤抗原特異性抗體的水平，探討B(tài)/DRibbles疫苗能否增強(qiáng)DRs疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及其抗腫瘤作用。
　　4.采用OT-1小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞作為初始T細(xì)胞，體外與單獨(dú)DRibbles(OVA+)、單獨(dú)B細(xì)胞、負(fù)載D

13、Ribbles(OVA+)或腫瘤細(xì)胞裂解液的小鼠B細(xì)胞共孵育5天，單獨(dú)的培養(yǎng)基和OT-1 peptide SIINFEKL分別作為陰性和陽性對照。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CFSE標(biāo)記的OT-1初始T細(xì)胞的增殖。B/DRibbles(OVA+)疫苗首次免疫并同時(shí)伴隨OT-1 T細(xì)胞的尾靜脈回輸，3，6天后尾靜脈注射B/DRibbles(OVA+)疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫，并以單獨(dú)B細(xì)胞及未免疫組作為對照，第10天收獲上述小鼠脾臟即淋巴結(jié)組織，采用流式細(xì)

14、胞儀檢測體內(nèi)OT-1 T細(xì)胞的增殖。皮下接種小鼠T淋巴瘤細(xì)胞—EG7構(gòu)建小鼠淋巴瘤模型，第7天采用淋巴結(jié)注射以CpG、抗CD40抗體預(yù)處理或不處理的B/DRibbles(OVA+)疫苗作為首次免疫同時(shí)伴隨或不伴隨OT-1 T細(xì)胞的尾靜脈回輸，第10，14天以尾靜脈注射以CpG、抗CD40抗體預(yù)處理或不處理的B/DRibbles(OVA+)疫苗、DC/DRibbles(OVA+)方式進(jìn)行加強(qiáng)免疫，并以單獨(dú)B細(xì)胞及未免疫組作為對照，定期測量

15、檢測實(shí)體瘤大小以觀察B/DRibbles(OVA+)疫苗在抗腫瘤效應(yīng)中的作用;收獲上述小鼠的腫瘤組織、脾臟組織以及血清，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤組織浸潤C(jī)D4+T和CD8+T細(xì)胞的比例、脾臟細(xì)胞中IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的比例;采用ELISA檢測血清中抗EG7腫瘤抗原特異性抗體的水平，探討負(fù)載B/DRibbles(OVA+)疫苗能否誘導(dǎo)初始T細(xì)胞應(yīng)答及其抗腫瘤作用。
　　結(jié)果:
　　1.與正常小鼠及T

16、LR4-/-小鼠相比，DRibbles不能上調(diào)TLR2-/-、MYD88-/-敲除小鼠B細(xì)胞表面MHCⅡ類分子、共刺激分子CD86的表達(dá)，IL-6、IL-10和總IgM水平也明顯降低。DRibbles與小鼠脾臟B細(xì)胞孵育后能引起下游NF-kB信號通路中I-kBα及IKKα/β的磷酸化。HMGB1抗體封閉DRibbles刺激B細(xì)胞表面MHCⅡ類分子及CD86的表達(dá)的上調(diào)作用顯著低于未封閉DRibbles及同型對照抗體封閉DRibbles組

17、，HMGB1抗體封閉DRibbles刺激B細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-10和總IgM水平也明顯低于未封閉DRibbles及同型對照抗體封閉DRibbles組。DRibbles刺激FilipinⅢ封閉的B細(xì)胞表面MHCⅡ類分子及CD86的表達(dá)的上調(diào)作用顯著低于未封閉B細(xì)胞組，產(chǎn)生IL-6、IL-10和總IgM水平也明顯低于未封閉組。
　　2.體外負(fù)載DRibbles(OVA+)的B細(xì)胞能交叉遞呈DRibbles(OVA+)抗原誘導(dǎo)OT-

18、1效應(yīng)T細(xì)胞的增殖明顯高于單獨(dú)DRibbles組、單獨(dú)B細(xì)胞組及B細(xì)胞負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解液組。與正常小鼠及TLR4-/-小鼠相比，TLR2-/-、MYD88-/-敲除小鼠B細(xì)胞攝取DRibbles刺激特異性效應(yīng)CD8+T和CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平顯著降低。B細(xì)胞攝取HMGB1抗體封閉的DRibbles刺激特異性效應(yīng)CD8+T和CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平明顯低于未封閉DRibbles及同型對照抗體封閉DRibbles組。F

19、ilipinⅢ處理的B細(xì)胞攝取DRibbles刺激特異性效應(yīng)CD8+T和CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平亦明顯低于未封閉B細(xì)胞組。
　　3.在C57BL/6小鼠的EG7皮下移植瘤模型中，B/DRibbles(OVA+)疫苗加強(qiáng)免疫能增強(qiáng)DRs疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，過繼轉(zhuǎn)移OT-1細(xì)胞，腫瘤消除，小鼠可以正常生存;若不過繼OT-1細(xì)胞，可顯著抑制小鼠EG7模型的腫瘤生長，小鼠生存時(shí)間延長;B/DRibbles疫苗加強(qiáng)免疫荷瘤小鼠后，

20、能誘導(dǎo)有效的效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答，能顯著提高腫瘤組織中浸潤C(jī)D4+T和CD8+T細(xì)胞的比例。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，B/DRibbles疫苗加強(qiáng)免疫能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的腫瘤抗原特異性抗體IgM、IgG。聯(lián)合應(yīng)用CpG和抗CD40抗體優(yōu)化的B/DRibbles疫苗進(jìn)行三次免疫后，腫瘤消除，小鼠得以正常生存，并能引發(fā)高水平的效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答。
　　4.體外負(fù)載DRibbles(OVA+)的B細(xì)胞能交叉遞呈DRibbles抗原誘導(dǎo)OT-1初始T細(xì)胞的增殖明顯高于

21、單獨(dú)DRibbles組、單獨(dú)B細(xì)胞組及B細(xì)胞負(fù)載腫瘤細(xì)胞裂解液組。B/DRibbles(OVA+)疫苗能在體內(nèi)交叉遞呈DRibbles抗原活化初始OT-1 T細(xì)胞。在C57BL/6小鼠的EG7皮下移植瘤模型中，過繼轉(zhuǎn)移OT-1細(xì)胞，腫瘤消除，小鼠可以正常生存;若不過繼OT-1細(xì)胞，可顯著抑制小鼠EG7模型的腫瘤生長，小鼠生存時(shí)間延長;B/DRibbles疫苗免疫荷瘤小鼠后，能誘導(dǎo)有效的效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答，能顯著提高腫瘤組織中浸潤C(jī)D4+T和

22、CD8+T細(xì)胞的比例。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，B/DRibbles疫苗免疫能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的腫瘤抗原特異性抗體IgM、IgG。聯(lián)合應(yīng)用CpG和抗CD40抗體優(yōu)化的B/DRibbles疫苗進(jìn)行三次免疫后，能引發(fā)高水平的效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答，可以增強(qiáng)抗腫瘤效果，但依然沒有使腫瘤消退，需要進(jìn)一步優(yōu)化條件。
　　結(jié)論:
　　1.DRibbles活化B細(xì)胞依賴TLR2-MyD88-NF-κB信號通路。DRibbles所含內(nèi)源性危險(xiǎn)信號分子HMGB1與B細(xì)胞

23、的活化有密切關(guān)系。Caveolae(細(xì)胞質(zhì)膜微囊)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用(endocytosis)與DRibbles誘導(dǎo)B細(xì)胞活化有密切關(guān)系。
　　2.B細(xì)胞能有效交叉遞呈DRibbles抗原并刺激效應(yīng)CD4+T和CD8+T細(xì)胞的再活化及分泌IFN-γ，該作用依賴B細(xì)胞的TLR2/MyD88信號通路。DRibbles所含內(nèi)源性危險(xiǎn)信號分子HMGB1與B細(xì)胞交叉遞呈DRibbles刺激效應(yīng)CD4+T和CD8+T細(xì)胞的再活化有密切關(guān)系。C

24、aveolae(細(xì)胞質(zhì)膜微囊)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞(endocytosis)與B細(xì)胞交叉遞呈DRibbles抗原并刺激效應(yīng)CD4+T和CD8+T細(xì)胞再活化有密切關(guān)系。
　　3.B/DRibbles加強(qiáng)免疫能增強(qiáng)DRibbles疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及其抗腫瘤作用;聯(lián)合應(yīng)用CpG和抗CD40抗體能有效加強(qiáng)B/DRibbles疫苗的抗腫瘤作用。
　　4.B/DRibbles首次免疫能誘導(dǎo)抗原特異性初始T細(xì)胞免疫應(yīng)答及抗腫瘤作用;聯(lián)合CpG