反義TIMP-1寡核酸轉(zhuǎn)染成纖維細胞抑制尿道瘢痕的實驗研究.pdf

1、各種原因造成的尿道狹窄、尿道缺損仍然是泌尿外科的難題之一，臨床上多采用包皮皮瓣、陰囊皮瓣、口腔黏膜、結(jié)腸黏膜等來重建尿道，其中，口腔黏膜是近年來廣泛應(yīng)用的修復材料，包括頰黏膜和舌粘膜，近年來在臨床上被廣泛應(yīng)用且大量的臨床結(jié)果表明修復效果良好。但口腔黏膜存在取材部位并發(fā)癥、取材量受限等問題。組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，為尿道重建提供了新的方法。其基本原理就是將具有生物活性的種子細胞與支架材料相結(jié)合，組成機體需要的、具有特定活性的替代材料以修復

2、尿道缺損。但在組織修復過程中，尿道瘢痕的產(chǎn)生也是不可避免。如何既能保持口腔黏膜的修復功能，又不至于在修復的過程中不產(chǎn)生過多的瘢痕，一直是尿道修復領(lǐng)域中的重點和難點。目前尿道瘢痕過度增生的有效調(diào)控的基礎(chǔ)研究正越來越受到學術(shù)界的重視，其中金屬蛋白酶抑制因子—1(TIMP-1)的表達升高，可能是其膠原沉積增加的主要原因。反義TIMP-1寡核苷酸可抑制尿道瘢痕成纖維細胞TIMP-1的表達，增加膠原酶的活性，同時在高濃度時可抑制細胞的增殖，在膠原

3、的降解和產(chǎn)生兩方面發(fā)揮作用，減少了膠原在細胞外的沉積。因此抑制膠原合成、促進其降解是防止瘢痕形成的關(guān)鍵。由此我們設(shè)想，將口腔黏膜細胞接種于生物支架黏膜面的同時，將成纖維細胞接種于生物支架的底面，可構(gòu)建更接近生理結(jié)構(gòu)的組織工程口腔黏膜;與此同時，運用反義核酸技術(shù)，減少成纖維細胞膠原基質(zhì)的過度合成和分泌，則既可充分利用成纖維細胞的修復創(chuàng)傷的作用，又可防止術(shù)后瘢痕的發(fā)生，從而極大改善重建尿道黏膜修復的效果。本研究探討應(yīng)用成纖維細胞轉(zhuǎn)染反義TI

4、MP-1寡核苷酸，以口腔上皮細胞復合小腸粘膜下層脫細胞基質(zhì)構(gòu)建組織工程口腔黏膜來重建尿道的可行性，探討金屬蛋白酶抑制因子—1(TIMP-1)在組織工程修復尿道瘢痕愈合過程中的作用，不至于產(chǎn)生過度瘢痕，以期為組織工程黏膜修復尿道提供理論和實驗依據(jù)，全文共分四章:
　　第一章種子細胞的培養(yǎng)和鑒定
　　1目的
　　探討犬成纖維細胞(fibroblasts，F(xiàn)B)、口腔上皮細胞(oralkeratinocyte，OK)分離、體

5、外培養(yǎng)增殖及鑒定方法。
　　2材料和方法
　　應(yīng)用膠原酶消化法分離培養(yǎng)犬成纖維細胞，倒置顯微鏡觀察，同時進行免疫細胞化學鑒定和半乳糖苷酶染色。結(jié)果分離的成纖維細胞可在體外快速生長、增殖。波形蛋白免疫細胞化學染色95％以上為陽性。
　　應(yīng)用DispaseⅡ分離犬口腔上皮層，胰酶消化分離獲得犬OK，在i3T3滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)基擴增，免疫熒光檢測細胞AE1/AE3的表達，獲得足量細胞后利用流式細胞儀檢測細胞表面AE1/AE3的表

6、達率。
　　3結(jié)果
　　原代培養(yǎng)3天后可見成纖維細胞貼壁生長，約5天左右細胞融合可達80-90％，可傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下可見長梭形細胞生長，蘇木素-伊紅染色可見細胞呈漩渦狀、平行排列，第5代細胞免疫熒光檢測波形蛋白(vimentin)表達陽性。
　　OK原代培養(yǎng)3天后可見貼壁生長，約15天左右細胞融合達到80-90％。顯微鏡下見OK呈多角形，細胞融合后呈典型的“鋪路石”狀外觀。傳代后將P1OK接種至絲裂霉素滅活的

7、3T3(i3T3)培養(yǎng)基培養(yǎng)、擴增，可見OK細胞呈集落樣生長，約6天細胞融合達90-94％。流式細胞儀檢測P3OKAE1/AE3表達率為87.4％。
　　4結(jié)論
　　利用膠原酶消化法可獲得一定量的成纖維細胞，來源廣泛，獲取簡單，并且創(chuàng)傷小。成纖維細胞形態(tài)一般呈長梭形細胞生長，蘇木素-伊紅染色可見細胞呈漩渦狀、平行排列，第5代細胞免疫熒光檢測波形蛋白(vimentin)表達陽性。
　　DispaseⅡ能將犬口腔上皮表皮層

8、脫離，將表皮層粉碎后用胰酶消化，能獲得大量OK，方法簡單，創(chuàng)傷小。OK呈扁平、多邊形，形狀不規(guī)則，細胞融合后呈典型的“鋪路石”狀外觀。細胞生長緩慢，2-3代后即衰老變性。在i3T3培養(yǎng)基上，OK表現(xiàn)出旺盛的增殖力，細胞生長迅速，能保持7-8代穩(wěn)定增殖。流式細胞檢測表明，P3OK中AE1/AE3表達率達到87.4％。
　　第二章犬成纖維細胞Timp-1基因的提取與鑒定
　　1.目的
　　通過犬成纖維細胞的培養(yǎng)，篩選出具有

9、高的siRNA干擾力的TIMP-1轉(zhuǎn)染基因。
　　2.方法
　　將成纖維細胞裂解后先行RNA提取，用分光光度計測定抽提的RNA濃度和純度。去除樣品中DNA污染，在去除了DNA污染的RNA樣品中加入oligo(dT)18primer1μL，進行cDNA第一鏈合成。合成后的cDNA樣品-20℃保存。最后進行Realtime-PCR。
　　3.結(jié)果
　　取相對定量的方法檢測目的基因的表達變化，按照2-△△CT岍法對數(shù)據(jù)

10、進行分析處理。
　　4結(jié)論
　　在犬成纖維細胞中含有siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、不含siRNA和對照組的TIMP基因的干擾力分別為49.57％、15.03％、-49.34％、12.78％和0.00％。含siRNA-1干擾基因的TIMP-1具有較高的干擾力。
　　第三章小腸粘膜下層脫細胞基質(zhì)(SIS)的制備、與含TIMP基因的成纖維細胞和OK體外構(gòu)建組織工程口腔粘膜的實驗研究
　　1目的

11、　　探討SIS的生物相容性，以及與成纖維細胞和OK體外構(gòu)建組織工程口腔粘膜的可行性。
　　2方法
　　將豬小腸清洗后，鈍性去除粘膜層和漿肌層，獲得小腸粘膜下層，以1％的Triton-X100與0.1％NH3H2O脫細胞，以1∶1的甲醇/氯仿脫脂處理，反復沖洗后行凍干，密封包裝后以25kGy的劑量行Co60輻照滅菌。將所得的SIS行HE染色、Masson染色觀察有無細胞殘留及膠原纖維形態(tài)，掃描電鏡觀察材料表面的纖維分布和表面特

12、點。將SIS浸泡于DMEM培養(yǎng)液中1周，取浸泡DMEM液培養(yǎng)ADSC，繪制生長曲線，觀測SIS浸泡液對細胞增殖速率的影響，以此評估SIS的生物相容性。
　　將成纖維細胞種植到SIS上，3天后將成纖維細胞-SIS翻轉(zhuǎn)置于不銹鋼網(wǎng)上，反面種植OK，用混合培養(yǎng)基在液-氣平面培養(yǎng)OK-SIS-成纖維細胞復合物7天，行掃描電鏡觀察細胞在支架上的生長，HE染色觀察該組織工程復合物的組織學特點，與OK-SIS作對比，觀察成纖維細胞的存在對新生上

13、皮的影響。
　　3結(jié)果
　　HE染色和Masson染色表明所得SIS無細胞殘留，保持完整的膠原纖維成分。掃描電鏡下SIS表面膠原纖維呈現(xiàn)裂隙樣結(jié)構(gòu)，利于細胞的黏附、長入。
　　掃描電鏡結(jié)果表明，成纖維細胞和OK均能在SIS表面良好黏附、生長。HE染色表明，與OK-SIS對比，OK-SIS-FB復合物表面上皮層結(jié)構(gòu)更為致密、更為厚，上皮層形態(tài)更好。
　　4結(jié)論
　　SIS生物相容性良好，F(xiàn)B和OK均能在其表面

14、良好生長。成纖維細胞的存在也利于體外培養(yǎng)環(huán)境下新上皮層的形成，利用SIS、OK和成纖維細胞體外構(gòu)建組織工程口腔黏膜是可以試驗的。
　　第四章組織工程化OK-SIS-成纖維細胞復合物用于犬尿道重建的實驗研究
　　1目的
　　探討組織工程化OK-SIS-成纖維細胞復合物在尿道重建的可行性，以及重建尿道后的瘢痕生長情況。
　　2方法
　　分別采用單純的SIS及組織工程化OK-SIS-成纖維細胞復合物對雌性Beag

15、le犬行5cm長尿道黏膜替代修補，剝除5cm尿道黏膜后，將修復材料縫合于尿道床上，與兩端正常尿道黏膜縫合，留置8號導尿管。術(shù)后3周拔除導尿管，在術(shù)后5、9、13、17、21、25周進行尿道造影，25周后行組織學檢測。
　　3結(jié)果
　　SIS重建尿道組術(shù)后5周尿道造影顯示修復段發(fā)生尿道狹窄，瘢痕組織增生明顯，該組1只犬在術(shù)后7周死于尿潴留繼發(fā)感染。OK-SIS-成纖維細胞復合物重建尿道組3只犬，其中1只犬成活良好至試驗結(jié)束，各