抑制素α基因RNAi片段轉基因小鼠的干擾效果及其機理的初步研究.pdf

1、水牛是我國南方重要的地方品種，具有較強抗病及耐粗飼特性;水牛奶比荷斯坦奶牛的牛奶具有更高的蛋白率和乳脂率，在肉用和乳用等方面均具有很大的潛力，然而，水牛較低的繁殖性能制約著水牛業(yè)的發(fā)展。抑制素(Inhibin，INH)是重要的生殖激素，通過負反饋調節(jié)抑制促卵泡素(FSH，F(xiàn)ollicle-stimulating hormone)的合成與分泌來抑制卵巢的發(fā)育和卵泡的成熟以及精子的發(fā)生與成熟，目前已經開展了通過研制INH單基因疫苗免疫提高豬

2、、小鼠等動物繁殖力的研究。
　　為了通過持續(xù)干擾INHα基因來改善水牛的繁殖性能，本研究利用顯微受精技術和轉基因技術將水牛INHα基因RNAi片段（B和C）和小鼠INHα基因RNAi片段（M和C，其中片段C為針對水牛和小鼠中相同CDs序列設計的）分別整合到小鼠基因組中（公司協(xié)助），以該三個不同RNAi片段轉基因陽性小鼠為研究材料，比較分析INHα基因三個不同RNAi片段的干擾作用及其效果，為研究INHα基因功能以及其在提高繁殖性能

3、打下基礎。本實驗主要的結果如下:
　　1、INHα基因的三個不同RNAi片段的干擾作用及其效率的研究(1) INHα基因的RNAi片段干擾效率的分析:在F3代3周齡轉基因雌鼠中，采用PCR技術檢測其陽性;然后，利用QPCR技術分析該轉基因陽性雌鼠的三個干擾片段的干擾效率，其干擾效率為C(96.1％)＞M(75.1％)＞B(27.5％)，可能是由于C片段是根據(jù)水牛和小鼠INHα基因共同CDs序列設計的且與干擾轉錄靶位點有關;

4、　　(2) INHα基因的RNAi片段陽性率的分析:提取F3代個體基因組DNA，用PCR分析后代轉基因子鼠陽性比率，B、C和M片段在F3代中陽性率依次為81.3％、51.1％和77.6％，即陽性率B＞M＞C;
　　(3) INHα基因的RNAi片段對產仔性能作用的分析:統(tǒng)計和分析三個不同干擾片段轉基因陽性小鼠連續(xù)三代第一胎產仔數(shù)，與野生小鼠相比，轉基因小鼠后代的產仔數(shù)略有增加，B和M片段在F1、F2代第一胎產仔數(shù)有所增加，但沒有顯

5、著差異（P＞0.05）。此外，比較三個不同干擾片段轉基因陽性小鼠不同胎次產仔數(shù)，發(fā)現(xiàn)產仔數(shù)隨胎次的增加有所下降，且低于野生型小鼠;
　　(4) INHα基因的RNAi片段對生殖激素、生殖腺重量影響的分析:ELISA方法檢測F3代轉基因小鼠血液中FSH、雌激素和雄激素的水平，結果表明這三種激素水平均有所上升。與野生型小鼠相比，3周齡F3代轉基因小鼠的睪丸、卵巢及出生均重均顯著增加（P＜0.05）;
　　2、攜帶B干擾片段轉基因

6、小鼠不同交配方式轉基因后代干擾效果的比較分析:
　　根據(jù)試驗結果，選擇遺傳穩(wěn)定性較好、繁殖性能略高和生殖器官略重、根據(jù)水牛INHα基因序列設計的B干擾片段轉基因小鼠，進行不同交配方式配種(B×B、B×WT，以野生型WT×WT為對照)。
　　(5) INHα基因的RNAi片段不同配種方式對INHα基因干擾效率影響分析:B×WT型小鼠的干擾效率低于攜帶B×B純合小鼠后代，但干擾效率均達到70％以上，此外該雜交后代其陽性比率高于純

7、合后代;
　　(6) INHα基因的RNAi片段不同配種方式對小鼠成活、血液免疫相關指標影響的分析:轉基因小鼠(B×B、B×WT)存活率高于野生型;血常規(guī)分析顯示單核細胞數(shù)MO減少，淋巴細胞數(shù)LY增多，而紅細胞數(shù)RBC顯著增加（P＜0.05）;
　　(7) INHα基因的RNAi片段不同配種方式對睪丸支持細胞凋亡影響的分析:利用流式細胞儀檢測技術分析了睪丸支持細胞的凋亡水平，轉基因小鼠(B×B)睪丸支持細胞凋亡率(5.4％)

8、顯著高于野生型小鼠(1.46％)。QPCR檢測相關凋亡因子P53和Bcl2，結果顯示這兩者mRNA水平均顯著下調，但抗凋亡因子Bcl2表達水平下降的程度比促凋亡因子P53更高;
　　(8) INHα基因的RNAi片段不同配種方式對支持細胞相關基因表達影響的分析:支持細胞上骨橋蛋白OPN(Osteopontin)在轉基因小鼠(B×B、B×WT)體內表達顯著上升（P＜0.05）、FSH受體基因FSHR表達下降;細胞熒光實驗表明二者均定