TRAIL與LDM聯(lián)用和作用機(jī)制及TRAIL蛋白的表達(dá).pdf

1、第一部分力達(dá)霉素聯(lián)合TRAIL對(duì)人非小細(xì)胞肺癌的協(xié)同作用及其相關(guān)機(jī)制研究
　　 背景與目的：研究烯二炔類抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素(LDM)與腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)聯(lián)合作用對(duì)人非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞的增效作用及其作用機(jī)制。
　　 方法：采用MTT法觀察LDM和/或TRAIL聯(lián)合用藥對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H460細(xì)胞增殖的抑制作用。利用Annexin V-FITC/PI雙染、流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst333

2、42熒光染色方法檢測(cè)兩藥聯(lián)合對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。采用Western blot檢測(cè)在不同濃度LDM作用條件下TRAIL受體DR4、DR5的表達(dá)情況和凋亡通路中PARP、Caspase3和Caspase8分子的變化。
　　 結(jié)果：LDM和TRAIL均能夠抑制人非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞的增殖，MTT結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合抑制效果增強(qiáng)，其CDI＜1，具有協(xié)同作用。LDM與TRAIL單獨(dú)用藥IC50值分別為4.60×10-10mol/L和915

3、ng/mL，LDM與TRAIL兩者聯(lián)合后作用效果增強(qiáng)，在50ng/mL、100ng/mL TRAIL濃度下LDM的IC50值分別為3.06×10.11mol/L和1.61×10-11mol/L。熒光顯微鏡下觀察在50ng/mL TRAIL或1×10-10mol/L LDM作用8h下H460細(xì)胞少量凋亡，而兩者聯(lián)合作用下絕大部分H460細(xì)胞均已凋亡。兩藥單獨(dú)作用以及聯(lián)合作用于H460細(xì)胞12小時(shí)后，1×10-10mol/LLDM作用組的細(xì)

4、胞凋亡率為26.1％,50ng/mL TRAIL作用組的細(xì)胞凋亡率為62.3%，聯(lián)合作用組的細(xì)胞凋亡率為74.7%，顯著高于對(duì)照組。與單獨(dú)用藥組相比，聯(lián)合用藥組中caspase-3和caspase-8的活性明顯增強(qiáng)，因此，聯(lián)合用藥組中H460細(xì)胞的凋亡率也明顯增加。Western blot結(jié)果顯示LDM能夠增強(qiáng)TRAIL受體DR5的表達(dá)，不僅有劑量依賴性，且時(shí)間越長(zhǎng)，表達(dá)量越高。而LDM在時(shí)間和濃度上對(duì)TRAIL受體DR4的表達(dá)卻幾乎沒(méi)

5、有影響。
　　 結(jié)論：LDM對(duì)人非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，并能夠通過(guò)誘導(dǎo)DR5表達(dá)而促進(jìn)TRAIL引起的腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。
　　 第二部分TRAIL蛋白的構(gòu)建表達(dá)及生物學(xué)活性研究
　　 背景與目的：本研究的目的是從人胎盤(pán)組織中獲取TRAIL基因，并在大腸桿菌中大量表達(dá)，分離純化后對(duì)其相關(guān)生物學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè)。
　　 方法：采用兩步法RT-PCR從胎盤(pán)組

6、織中獲取TRAIL基因，采用PCR擴(kuò)增和DNA克隆技術(shù)獲得sTRAIL序列，并在3’端插入組氨酸標(biāo)簽編碼序列。將該重組基因經(jīng)過(guò)雙酶切后插入到pET30a(+)表達(dá)載體中，得到重組表達(dá)載體。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)starTM中，加入0.2mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)情況。裂解菌體后可得到包涵體，包涵體變性后采用Ni2+親和層析法分離純化得到目的蛋白，Western Blot對(duì)純

7、化出的融合蛋白進(jìn)行鑒定。產(chǎn)物采用ELISA檢測(cè)了其與受體的結(jié)合活性。
　　 結(jié)果：經(jīng)過(guò)RT-PCR得到了TRAIL基因，將其插入到表達(dá)載體后成功實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)。產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在于大腸桿菌中，Ni2+親和層析對(duì)其進(jìn)行分離純化，得到的目的蛋白量為每升發(fā)酵液得到3mg活性蛋白。Western blot證實(shí)了純化的蛋白為帶有His-tag標(biāo)簽的目的蛋白。ELISA結(jié)果顯示蛋白對(duì)人非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞有很強(qiáng)的結(jié)合活