新生大鼠缺氧缺血性腦損傷對(duì)松果體功能的影響及外源性褪黑素的神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、第一篇新生大鼠缺氧缺血性腦損傷改良模型的建立和鑒定
　　 目的：本研究通過(guò)改良Rice的HIBD新生大鼠模型，建立穩(wěn)定可靠的新生大鼠中、重度缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型，應(yīng)用多種方法鑒定建模是否成功，降低傳統(tǒng)制模方法中實(shí)驗(yàn)大鼠的死亡率，為HIBD的進(jìn)一步研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
　　 方法：取7日齡新生Sprague—Dawley(SD)大鼠，隨機(jī)分三組，改良的HIBD模型(G組)、傳統(tǒng)的Rice模型(C組)和對(duì)照組(S

2、組)，分別于建模后6小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)取材，觀察模型鼠行為改變、大腦解剖標(biāo)本并使用HE染色、免疫組化、細(xì)胞凋亡鑒定建模成功與否。
　　 結(jié)果：
　　 1．G組鼠建模時(shí)普遍出現(xiàn)全身性抽搐、右側(cè)肢體抽搐、角弓反張及身體自發(fā)性左旋；而C組鼠只有少部分出現(xiàn)右下肢癱瘓及抽搐。
　　 2．G組SD大鼠左側(cè)大腦半球呈現(xiàn)出現(xiàn)水腫、蒼白、液化壞死的發(fā)生率約為63％，明顯萎縮率達(dá)91％：C組建模后72小時(shí)仍無(wú)空洞及液化形成。C

3、組與G組比較，左腦皮質(zhì)及海馬區(qū)水腫程度較輕，神經(jīng)元數(shù)目減少不明顯。
　　 3．G組HIBD后6小時(shí)可見左腦皮質(zhì)NSE著色細(xì)胞呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，48小時(shí)NSE酶活性喪失達(dá)到高峰，72小時(shí)NSE酶活性漸恢復(fù)。G組HIBD后48小時(shí)凋亡最明顯，72小時(shí)凋亡細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目仍減少，與C組比較有顯著性差異(p＜0.01)。
　　 4．G組在缺氧結(jié)束后未見動(dòng)物死亡。C組麻醉過(guò)程中死亡4只，缺氧過(guò)程中死亡8只。存活率有顯著性差異(P＜0

4、.01)。
　　 結(jié)論：
　　 多種方法學(xué)鑒定了改良后的Rice建模方法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率低、成功率高的基礎(chǔ)上可以成功建立中、重度缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型。
　　 第二篇新生大鼠缺氧缺血性腦損傷對(duì)松果體功能的影響
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察松果體中褪黑素(MLT)合成酶芳香烷基胺—N—乙?；D(zhuǎn)移酶(AANAT)、羥基吲哚—O—甲基轉(zhuǎn)移酶(HIOMT)信使核糖核酸(mRNA)的表達(dá)，誘生型一氧化氮合酶(ind

5、uceNitricOxideSynthase，iNOS)的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，了解松果體功能與HIBD的關(guān)系；放射性免疫法測(cè)定外周血MLT水平。
　　 方法：
　　 將SPF級(jí)7日齡Sprague—Dawley(SD)隨機(jī)分組，HIBD組(T)和假手術(shù)組(S)各30只，模型完成后第6、12、24、48、72小時(shí)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取松果體標(biāo)本和心臟采血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。電鏡觀察松果體形態(tài)學(xué)改變，測(cè)定各組不同時(shí)間點(diǎn)松果體中AANA

6、TmRNA、HIOMTmRNA的表達(dá)。觀察松果體細(xì)胞的iNOS表達(dá)及細(xì)胞凋亡，放免法測(cè)外周血MLT的濃度。
　　 結(jié)果：
　　 1．松果體中AANATmRNA的表達(dá)水平：HIBD后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)AANATmRNA的表達(dá)水平均低于對(duì)應(yīng)假手術(shù)組；縱向比較各假手術(shù)組之間AANATmRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，HIBD后12小時(shí)開始下降，24小時(shí)達(dá)低峰，48小時(shí)有所回升，72小時(shí)恢復(fù)。
　　 2．松果體中H

7、IOMTmRNA的表達(dá)水平：與對(duì)應(yīng)假手術(shù)組相比，HIBD后各組HIOMTmRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯變化；縱向比較假手術(shù)各組之間及HIBD后各組之間HIOMTmRNA的表達(dá)水平均無(wú)明顯變化。
　　 3．iNOS：新生鼠腦損傷后松果體的iNOS6小時(shí)、48小時(shí)含量與對(duì)應(yīng)假手術(shù)組相比明顯升高。
　　 4．細(xì)胞凋亡：腦損傷后松果體凋亡細(xì)胞早期明顯增多，尤以6小時(shí)、48小時(shí)為主。
　　 5．電鏡觀察：腦損傷后松果體的形態(tài)學(xué)亦

8、以6小時(shí)、48小時(shí)改變?yōu)槊黠@，出現(xiàn)線粒體明顯腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)極度擴(kuò)張、細(xì)胞變性。
　　 6．血清MLT水平：與對(duì)應(yīng)假手術(shù)組相比，HIBD后24小時(shí)，48小時(shí)血清MLT濃度水平降低；縱向比較假手術(shù)各組MLT濃度水平無(wú)明顯變化，HIBD后24小時(shí)下降，48小時(shí)MLT水平與24小時(shí)基本相等，72小時(shí)恢復(fù)正常。
　　 結(jié)論：
　　 1．HIBD可導(dǎo)致松果體中褪黑素合成的關(guān)鍵酶AANAT的基因表達(dá)下降，HIBD后12小時(shí)開

9、始下降，24小時(shí)達(dá)低峰，48小時(shí)回升，72小時(shí)恢復(fù)正常；HIBD后松果體中褪黑素合成的最后一個(gè)酶HIOMT的基因表達(dá)水平變化不明顯。
　　 2．HIBD可導(dǎo)致外周血MLT濃度減低，24小時(shí)開始下降，持續(xù)至48小時(shí)，72小時(shí)恢復(fù)。降低了MLT的內(nèi)源性保護(hù)作用可能參與早期HIBD的發(fā)病機(jī)制。
　　 3．HIBD早期松果體功能下降，下調(diào)AANAT的基因表達(dá)是HIBD早期松果體功能下降的“引擎”。
　　 4．腦損傷后6小

10、時(shí)、48小時(shí)松果體細(xì)胞的iNOS表達(dá)增加，以后逐漸下降，72小時(shí)基本恢復(fù)。
　　 5．TUNEL法原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡與iNOS表達(dá)同步改變，iNOS表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。iNOS表達(dá)和TUNEL法細(xì)胞凋亡參與了新生鼠缺氧缺血性腦損傷后松果體細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　 第三篇外源性褪黑素對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用研究
　　 目的：探討褪黑素(melatonin，MLT)對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(hyp

11、oxic—ischemicbrain damage，HIBD)的神經(jīng)保護(hù)作用以及MLT的用藥時(shí)間窗。
　　 方法：
　　 選用7日齡的SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、模型組(HIBD組)、MLT治療組(按給藥時(shí)間分為HIBD前組、HIBD后0小時(shí)組、HIBD后1小時(shí)組、HIBD后2小時(shí)組)。建立新生鼠HIBD模型后，于不同時(shí)間點(diǎn)取材，腦組織分別行HE染色觀察組織病理變化，原位末端標(biāo)記技術(shù)(terminal de

12、oxynucleotidyl transferasemediated dUDP—biotin nick end labeling，TUNEL)檢測(cè)皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元的凋亡，免疫組化法檢測(cè)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neurone specific enolase，NSE)的表達(dá)，心臟采血分離血清后用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme—linked immunosorbentassay，ELISA)檢測(cè)NSE的水平，并比較各組之間的差異。
　　

13、 結(jié)果：
　　 1．TUNEL，法顯示皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元的凋亡細(xì)胞于缺氧缺血后6小時(shí)漸增多，24小時(shí)達(dá)高峰，然后逐漸下降，MLT治療組組間存在差異，但各組在6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)均顯著低于HIBD組(p＜0.01)。
　　 2．腦組織中NSE的變化與血清中NSE的變化顯著相關(guān)(r=—0.92)，NSE在缺氧缺血后6小時(shí)開始升高，24小時(shí)達(dá)高峰后漸回落，MLT治療組組間存在差異，但各組在6小時(shí)、12小

14、時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)均顯著優(yōu)于HIBD組(p＜0.01)。
　　 3．MLT治療組組間比較，HIBD前組、HIBD后0小時(shí)組、HIBD后1小時(shí)組各項(xiàng)指標(biāo)的變化差異性不明顯(p＞0.05)，但它們與HIBD后2小時(shí)組在各項(xiàng)指標(biāo)的變化上有顯著性差異(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．褪黑素對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷有預(yù)防和治療作用。
　　 2．腦組織中NSE的變化與血清中NSE的變化有顯著