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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:流行病學(xué)調(diào)查表明,病態(tài)竇房結(jié)綜合征(sick sinus syndrome,SSS,簡(jiǎn)稱病竇),是臨床難治性的重大疑難心血管疾病,屬慢性漸進(jìn)性疾病,高發(fā)病率、高危險(xiǎn)性已經(jīng)引起人們的普遍關(guān)注。因此,病竇的治療及研究成為亟待解決的醫(yī)學(xué)疑難問題。SSS目前尚無根治措施,西醫(yī)治療以阿托品、腎上腺素、氨茶堿等藥物提高心率為主,副作用大;安裝及更換單腔起搏器大約為2.89萬費(fèi)用較貴,且存在嚴(yán)重的禁忌癥和并發(fā)癥[1]。因此,尋求安全、有效、廉價(jià)
2、的治療方法成為一種迫切需要。
竇房結(jié)是心臟自律性的發(fā)源地,其起搏功能的正常對(duì)維持心臟正常的泵血功能尤為重要。早在上個(gè)世紀(jì)50年代,細(xì)胞膜興奮理論認(rèn)為,細(xì)胞膜離子通道的綜合作用是心臟起搏的主要機(jī)制(membrane clock,膜鐘),其中包括超極化激活的起搏電流(If)、內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)、SCN5A編碼的鈉電流(INa)、鈣電流(ICa)等。竇房結(jié)細(xì)胞(SNC)超極化激活環(huán)核苷酸門控(HCN)通道(hyperpolar
3、ization-activated current,簡(jiǎn)稱If通道)在維持SNC自律性方面具有舉足輕重的作用,SSS的產(chǎn)生與SNC結(jié)構(gòu)的破壞、活性和自律性的降低直接相關(guān)。
近年研究表明,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為SSS臨床表現(xiàn)以本虛標(biāo)實(shí)為主,本虛以氣虛、陽虛多見,提出從整體入手,通過多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)緩解病情,提高患者生存率、改善生存質(zhì)量。中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院劉志明老中醫(yī)臨證70余年經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為SSS的臨證以陽虛血瘀為主,故提煉治療SSS有效方
4、劑—通陽活血方(THR),為原創(chuàng)經(jīng)驗(yàn)方。前期對(duì)該方進(jìn)行了多中心臨床研究表明該方治療病竇療效確切、安全性好;基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究表明該方通過多靶點(diǎn)、多途徑起作用。因此,深入挖掘名老中醫(yī)治療病竇的寶貴經(jīng)驗(yàn),探討修復(fù)受損竇房結(jié)結(jié)構(gòu)和功能的電生理機(jī)制,具有重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。
目的:在以往用于細(xì)胞研究的乳兔竇房結(jié)細(xì)胞(SNC)分離方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良,成功分離、培養(yǎng)出適用于全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)的乳兔SNC,進(jìn)一步探討THR含藥血清、中藥原液以
5、及主要有效成分對(duì)乳兔缺血再灌SNC動(dòng)作電位(AP)相關(guān)參數(shù)、起搏電流的影響和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,以揭示THR治療SSS的細(xì)胞電生理機(jī)制,為名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方治療病竇提供科學(xué)依據(jù),為傳承名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)提供借鑒。
方法:
1.將采用“雙酶解+差速貼壁”法分離的乳兔SNC分為正常組、模型組、100、200、300μl通陽活血含藥血清組及100μl空白血清組,除正常組,其余各組細(xì)胞均模擬缺血-再灌注(I-R)法制備乳兔SNC損傷模型,并
6、利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察空白血清及通陽活血方含藥血清對(duì)各組SNC自發(fā)性搏動(dòng)頻率、作電位時(shí)程APD20、APD50、APD90、最大舒張電位(MDP)、動(dòng)作電位幅值(APA)的影響。
2.將采用“雙酶解+差速貼壁”法分離的乳兔SNC分為正常組、模型組、100、200、300μl含藥血清組及通陽活血中藥原液組,除正常組,其余各組細(xì)胞模擬I-R法制備SNC損傷模型,并利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察THR中藥原液及含藥血清對(duì)各組SNC超極化
7、環(huán)核苷酸門控陽離子通道電流起搏電流(If)電流-電壓曲線及相關(guān)門控機(jī)制的影響。
3.將采用“雙酶解+差速貼壁”法分離的乳兔SNC分為正常組、模型組、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L人參Rb1、黃芪甲苷,除正常組,其余各組細(xì)胞模擬I-R法制備SNC損傷模型,并利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察人參Rb1、黃芪甲苷對(duì)各組SNC超極化環(huán)核苷酸門控陽離子通道電流起搏電流(If)電流-電壓曲線及相關(guān)門控機(jī)制的影響。
8、> 4.將采用“雙酶解+差速貼壁”法分離的乳兔SNC分為正常組、模型組、1μmol/L激動(dòng)劑Forskolin和100μmol/L選擇性抑制劑H89,除正常組,其余各組細(xì)胞模擬I-R法制備SNC損傷模型,并利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察Forskolin、H89高中低劑量對(duì)各組SNC超極化環(huán)核苷酸門控陽離子通道電流起搏電流(If)電流-電壓曲線及相關(guān)門控機(jī)制的影響。
結(jié)果:
1.“雙酶解+差速貼壁”差速貼壁5d后細(xì)胞主要
9、呈3種形態(tài):梭形、蜘蛛形與多邊形,梭形細(xì)胞數(shù)目最多(61.5±6.8),搏動(dòng)頻率快,(136±12)次/min;蜘蛛形細(xì)胞胞體較大,多伸有偽足,搏動(dòng)頻率較梭形細(xì)胞慢(106±9)次/min;少量多邊形細(xì)胞體積較大、少偽足且無搏動(dòng),細(xì)胞平坦、胞漿清亮。
2.與正常組比較,模擬I-R造模后SNC的APD20由正常(25.7±4.8)ms延長(zhǎng)至(82.6±5.3) ms,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),于造模后細(xì)胞外液分別加入1
10、00、200、300μl通陽活血方含藥血清后,APD20分別縮短至(42.7±6.7) ms、(53.3±6.5) ms、(41.5±6.4) ms,差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),三個(gè)含藥血清組之間比較則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與正常組比較,模擬I-R造模后SNC的APD50由正常(78.79±5.3) ms延長(zhǎng)至(152.5±5.6) ms,具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),于造模后細(xì)胞外液分別加入100、200、300μl通陽活血
11、方含藥血清后,APD50分別縮短至(98.2±6.4) ms、(123.9±4.9) ms、(114.2±4.9) ms,差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其中100μl含藥血清組縮短比200、300μl含藥血清組更明顯(P<0.05),但200μl和300μl含藥血清組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組比較,模擬I-R造模后SNC的APD90雖有延長(zhǎng),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。于造模后細(xì)胞外液分別加入100、200、300μl通陽活
12、血方含藥血清后,APD90的改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
3.與正常組比較,模擬I/R造模后SNC的MDP由正常的(-65.6±4.8)mV變?yōu)椋?53.9±5.8)mV,APA則由正常的(85.2±3.8)mV降低至(73.7±4.9)mV,均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。分別加入100、200、300μl通陽活血方含藥血清后,各組MDP值無明顯改變(P>0.05),100μl和300μl含藥血清分別使APA升
13、高至(84.3±4.8)mV和(83.4±6.3)mV,具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),但兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組比較,200μl含藥血清對(duì)APA雖有升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與模型組比較,100μl空白血清組MDP及APA均無明顯改變(P>0.05)。
4.正常組竇房結(jié)細(xì)胞If峰值電流密度為(-43.48±1.08)pA/pF,模擬I/R后SNC If峰值電流密度降至(-19.64±2.14)pA/pF,具有極顯著
14、性差異(P<0.01)。分別加入100、200、300μl通陽活血方含藥血清后,If峰值電流密度有不同程度的增大,分別升高至(-94.90±0.66)pA/pF、(-115.37±1.62)pA/pF、(-122.54±1.11)pA/pF(P<0.01)??瞻籽褰M與模型組比較,If峰值電流密度無明顯變化。分別于正常細(xì)胞外液加入100μl通陽活血方含藥血清及空白血清后,含藥血清組If峰值電流密度較正常組有所升高(P<0.05),空白血
15、清組則無明顯變化。模擬I/R后SNC在分別加入100、200、300μl通陽活血方原液后,If峰值電流密度亦有不同程度的增大,分別升高至(-60.27±1.47)pA/pF、(-69.70±1.67)pA/pF、(-76.03±1.59)pA/pF(P<0.01)。分別于正常細(xì)胞外液加入100μl通陽活血方中藥原液后,If峰值電流密度有所升高(P<0.01)。
5.正常組竇房結(jié)細(xì)胞If峰值電流密度為(-43.48±1.08)p
16、A/pF,模擬I/R后SNC If峰值電流密度降至(-19.64±2.14)pA/pF,具有極顯著性差異(P<0.01)。加入100、200、400μmol/L人參Rb1后,If峰值電流密度有不同程度的增大,分別升高至(-22.99±1.75)pA/pF(P<0.05)、(-24.39±2.38)pA/pF、(-40.55±1.33)pA/pF(P<0.01)。分別于正常細(xì)胞外液加入100μmol/L人參Rb1, If峰值電流密度較正常
17、組有所升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模擬I/R后SNC在分別加入100、200、400μmol/L黃芪甲苷后,If峰值電流密度亦有不同程度的增大,分別升高至(-30.43±1.98)pA/pF、(-34.83±1.6)pA/pF、(-52.72±1.7)pA/pF(P<0.01)。分別于正常細(xì)胞外液加入100μmol/L黃芪甲苷后,If峰值電流密度有所升高(P<0.05)。
6.正常組竇房結(jié)細(xì)胞If峰值電流密度為(-4
18、3.48±1.08)pA/pF,模擬I/R后SNC If峰值電流密度降至(-19.64±2.14)pA/pF,具有極顯著性差異(P<0.01)。參照文獻(xiàn),在浴液中加入10μmol/L H89后[9],If峰值電流密度有不同程度的減小,下降至(-11.56±2.34)pA/pF(P<0.01)。后于浴液中分別加入100μl的含藥血清和中藥原液,If峰值電流密度有不同程度的升高,分別升高至(-12.45±2.16)pA/pF(P>0.05)
19、、(-11.84±1.75)pA/pF(P>0.05)。在浴液中加入1μmol/L Forskolin后,If峰值電流密度有不同程度的上升至(-25.82±1.53)pA/pF(P<0.05)。后于浴液中分別加入100μl的含藥血清和中藥原液,If峰值電流密度有不同程度的升高,分別升高至(-61.03±2.48)pA/pF(P<0.01)、(-51.60±2.47)pA/pF(P<0.01)。
結(jié)論:
1.通陽活血方
20、含藥血清可加快乳兔受損SNC自發(fā)性搏動(dòng)頻率,縮短作電位時(shí)程APD20、APD50,增大乳兔受損SNC的APA,同時(shí)可保護(hù)乳兔受損SNC形態(tài)結(jié)構(gòu),從而提高心率。
2.通陽活血方含藥血清及中藥原液能電壓依賴性增大受損乳兔SNC的If電流密度,加快If通道穩(wěn)態(tài)激活,恢復(fù)降低的If電流密度,以縮短SNC動(dòng)作電位的舒張去極,從而提高其自律性。
3.人參Rb1、黃芪甲苷可電壓依賴性增大受損乳兔SNC的If電流密度,加快If通道穩(wěn)
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