雙鏈核糖核酸(dsRNA)的產(chǎn)生及其調(diào)控的信號通路在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展中的分子機制研究.pdf

1、目的：Alu RNA是人類基因組中SINE家族的最主要成員，B型RNA是與Alu RNA同源的小鼠SINE。近年來越來越多的研究顯示非編碼RNA與基因表達調(diào)控相關(guān)，與疾病相關(guān)。但 Alu序列約占人類基因組的10％，一直以來被認為是“垃圾”序列，所以，Alu RNA的產(chǎn)生及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用尚未闡明。急性肺損傷（acute lung injury，ALI）病死率高，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）則是其主要致

2、病物質(zhì)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)LPS等損傷性因素造成“呼吸爆發(fā)”導致的氧化應激在ALI的病理發(fā)展過程中扮演重要的角色。有研究提示氧化應激可誘導Alu RNA的產(chǎn)生，但ALI過程中Alu RNA的產(chǎn)生及其調(diào)控的分子機制尚未闡明。本課題將通過建立小鼠ALI模型，探討Alu RNA同源分子B型RNA如何參與急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展及其分子機制，為急性肺損傷的發(fā)病機制研究提供新的理論基礎。
　　方法和材料：本課題借助LPS誘導BALB/c小鼠ALI

3、模型，利用分子克隆技術(shù)、原代細胞培養(yǎng)技術(shù)、激光共聚焦技術(shù)、免疫組化技術(shù)、Real-Time PCR技術(shù)、Western blot技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)和MTS實驗分別在體外和體內(nèi)探討B(tài)型RNA參與急性肺損傷引起炎癥反應的過程，揭示B1 RNA激活NLRP3炎性小體及炎癥因子表達的機制。
　　實驗結(jié)果：
　　第一部分：LPS誘導小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮細胞產(chǎn)生B型RNA來源的雙鏈RNA
　　首先我們通過雙氧水刺

4、激 A549細胞建立氧化應激模型，使用特異性識別雙鏈RNA的抗體與提取的H2O2刺激的A549細胞總RNA進行斑點雜交，結(jié)果證實雙氧水刺激的A549細胞內(nèi)含有dsRNA，而這種dsRNA被證實是Alu RNA。然后我們利用可導致氧化應激反應的脂多糖LPS誘導人肺腺癌A549細胞，觀察LPS刺激過程中，是否也有Alu RNA的表達，結(jié)果證實LPS誘導的人A549細胞模型中Alu RNA的表達增加。在此基礎上，我們使用磁珠分選的方法分離獲得

5、小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮細胞，利用流式細胞技術(shù)鑒定了分離的原代Ⅱ型肺泡上皮細胞的純度；使用 LPS作用于細胞，建立原代Ⅱ型肺泡上皮細胞的ALI模型；LPS刺激24h后收取細胞，通過RNA免疫沉淀技術(shù)（RNA Binding Protein Immuno- precipitation，RIP）捕獲了細胞內(nèi)的dsRNA，利用T-A克隆的方法構(gòu)建了細胞內(nèi)dsRNA的cDNA文庫，并通過基因測序技術(shù)證實了dsRNA主要為B1 RNA。
　　第

6、二部分：LPS誘導小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮細胞B型RNA的表達和調(diào)控信號通路重要分子的活化
　　首先，通過qRT-PCR法檢測了LPS誘導的小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中B1、B2及B4 RNA的表達水平，我們證實LPS誘導Ⅱ型肺泡上皮細胞中B1和B2 RNA表達增加。
　　其次，發(fā)現(xiàn)LPS誘導的原代Ⅱ型肺泡上皮細胞中NLRP3炎性信號通路活化。通過qRT-PCR法檢測了LPS誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞中NLRP3、IL-1β、IL-18和

7、TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示LPS誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞中NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α的轉(zhuǎn)錄增加，ELISA實驗證實了IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌水平也明顯增加。
　　接下來，我們發(fā)現(xiàn)磷酸化的NF-κB介導了B1 RNA誘導的NLRP3信號通路的活化。Western blot和qRT-PCR實驗顯示LPS應激后Ⅱ型肺泡上皮細胞中不僅NLRP3及其下游細胞因子被上調(diào)，NF-κB亦被磷酸化激活；為了鑒定

8、NF-κB磷酸化與dsRNA的相關(guān)性，應用激光共聚焦實驗揭示了dsRNA表達增高，分布于細胞核及核周，并與磷酸化的NF-κB具有共定位關(guān)系，強烈提示NF-κB參與了NLRP3炎性通路的活化；通過在LPS誘導的原代Ⅱ型肺泡上皮細胞中使用 NF-κB磷酸化特異性抑制劑PDTC，qRT-PCR和ELISA實驗發(fā)現(xiàn)其顯著抑制了IL-1β、IL-18和TNF-α的轉(zhuǎn)錄和分泌；接下來，我們克隆并構(gòu)建了B1 RNA的真核表達載體，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1

9、-B1進入原代Ⅱ型肺泡上皮細胞，實驗證實，B1 RNA的轉(zhuǎn)染和過表達可顯著增加NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α的轉(zhuǎn)錄和翻譯，但該現(xiàn)象可被PDTC所抑制。
　　最后我們利用MTS法檢測了原代Ⅱ型肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)染B1 RNA后的細胞活力變化，結(jié)果顯示LPS處理和B1 RNA的轉(zhuǎn)染都能夠降低原代Ⅱ型肺泡上皮細胞的活力，相應地，這種抑制作用能夠被PDTC所改善。
　　第三部分：體內(nèi)實驗研究LPS誘導B型RNA的產(chǎn)生及其

10、調(diào)控的信號通路在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展中的分子機制
　　我們通過氣管灌注的方法建立LPS誘導的小鼠急性肺損傷動物模型，并分離小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮細胞，與體外實驗一致的是，qRT-PCR法證實了Ⅱ型肺泡上皮細胞中B1和B2的表達增加，Western blot實驗證實了NF-κB的磷酸化水平及NLRP3表達增加，ELISA實驗證實了IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌增加。并利用免疫組化實驗證實了LPS處理后小鼠肺組織中NF-κB磷酸

11、化，NLRP3的表達及dsRNA的增加。
　　結(jié)論：通過本課題研究，我們初步證實在LPS應激作用下，A549和小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中可產(chǎn)生Alu RNA來源的dsRNA。在小鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞中，這些雙鏈RNA以B1 RNA為主。小鼠體外和體內(nèi)實驗證實B1 RNA轉(zhuǎn)錄增加可上調(diào)NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α的表達。進一步通過檢測NF-κB磷酸化水平證實，B1 RNA可通過調(diào)節(jié)NF-κB磷酸化介導NLRP3以及促炎因