IL-32在病理性瘢痕中的生物學作用及IL-32重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、[目的]
　　本研究比較IL-32在正常皮膚和病理性瘢痕組織中的表達及分布情況，探討IL-32在病理性瘢痕的形成過程中所起的生物學作用及意義。同時，為進一步研究病理性瘢痕的防治，構(gòu)建能表達人IL-32的真核表達載體及含有人IL-32基因介導的重組腺相關(guān)病毒載體，為下一步轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細胞，觀察IL-32基因在細胞中表達后對細胞增長的影響奠定實驗基礎(chǔ)。
　　[方法]
　　1.以正常皮膚作為對照，應(yīng)用RT-PCR方法檢

2、測IL-32mRNA在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達水平。
　　2.以正常皮膚作為對照，應(yīng)用免疫組化檢測IL-32蛋白在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達及分布情況。
　　3.以正常皮膚作為對照，應(yīng)用Western Blotting檢測IL-32蛋白在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達及分布情況。
　　4.設(shè)計引物，合成目的片段IL-32(566bp)。
　　5.原始質(zhì)粒T-IL32的

3、構(gòu)建及鑒定。
　　6.重組質(zhì)粒pSNAV2.0-IL-32的構(gòu)建及鑒定。
　　7.病毒包裝細胞BHK-21的復(fù)蘇，培養(yǎng)，傳代，凍存。
　　8.構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒rAAV2-IL-32。
　　9.rAAV2-IL-32的大規(guī)模制備。
　　10.rAAV2-IL-32的目的基因的PCR鑒定。
　　11.rAAV2-IL-32的滴度測定。
　　[結(jié)果]
　　1.RT-PCR檢測IL-32mRNA

4、的結(jié)果:正常皮膚、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中IL-32mRNA均有表達。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩與正常皮膚相比較IL-32mRNA的表達明顯降低(P＜0.05），而增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中IL-32mRNA的表達無明顯的差別(P＞0.05）。
　　2.免疫組化檢測IL-32蛋白結(jié)果:IL-32蛋白在三者中均有表達。但IL-32蛋白在皮膚中表達較增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中強差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織

5、中表達無差異(P＞0.05）。
　　3.Western Blotting檢測IL-32蛋白結(jié)果:IL-32蛋白在皮膚、增生瘢痕和瘢痕疙瘩三組中均有表達。與正常皮膚相比，增生性瘢痕及瘢痕疙瘩IL-32蛋白的表達明顯降低(P＜0.05)。而在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中表達無差異（P＞0.05）。
　　4.應(yīng)用Overlapping PCR獲得目的基因片段經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增片斷約為570bp，與目的片斷大小基本符合，且無

6、非特異性擴增。
　　5.質(zhì)粒T-IL32經(jīng)用BglⅡ和KpnⅠ雙酶切酶切后電泳見大約570bp片段，與目的片斷符合。
　　6.pSNAV2.0-IL-32質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和BglⅡ雙酶切預(yù)期能產(chǎn)生大小分別7.1kb和570bp左右兩條帶而電泳結(jié)果與預(yù)期相符，該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確。
　　7.2.0-IL-32質(zhì)粒轉(zhuǎn)染六孔板中的BHK-21細胞，經(jīng)G418篩選后，取菌液經(jīng)PCR鑒定能夠特異地擴增出570bp左右大小的目的基因

7、條帶。
　　8.rAAV2-IL-32大規(guī)模制備后，測病毒滴度:約為5.2×1011 vg/ml。
　　[結(jié)論]
　　1.和正常皮膚相比，IL-32mRNA和IL-32蛋白增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中均有下降，提示IL-32基因在病理性瘢痕組織的形成中起著重要作用，IL-32基因可能通過各種機制影響病理性瘢痕的發(fā)生發(fā)展。預(yù)示IL-32基因?qū)⒊蔀椴±硇择：刍蛑委熜碌暮蜻x靶基因。
　　2.成功構(gòu)建了能表達人IL-32