FcγRⅢa的基因多態(tài)性、血清中抗體及補體對利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細胞對Raji細胞殺傷作用的影響.pdf

1、腫瘤特異性單克隆抗體(monoclonal antibody，MAb，簡稱單抗)是應(yīng)用雜交瘤技術(shù)針對腫瘤細胞表面的腫瘤相關(guān)抗原或特定的受體而制備出的MAb，可特異性識別腫瘤細胞抗原，選擇性地摧毀腫瘤細胞而健康細胞基本不受影響，為腫瘤患者的靶向免疫治療帶來了希望。針對特定腫瘤抗原的MAb殺傷腫瘤靶細胞的機理主要有三個方面：①抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicit

2、y，ADCC)溶解靶細胞；②通過補體依賴的細胞毒性(complement dependent cell cytotoxicity,CDC)；③直接和靶細胞結(jié)合促進腫瘤細胞凋亡。
　　 ADCC被證明是MAb臨床治療腫瘤的重要機制和手段。MAb首先通過抗原結(jié)合部位與靶細胞(腫瘤細胞)結(jié)合，再由效應(yīng)細胞上的FcγRⅢa識別其Fc段，介導(dǎo)ADCC作用。FcγRⅢa是唯一表達于NK細胞上可與IgG結(jié)合介導(dǎo)ADCC作用的Fc受體。FcγR

3、Ⅲa有三種基因型：FcγRⅢla-158F/F，F(xiàn)cγRⅢa-158V/V及FcγRⅢa-158V/F。FcγRⅢa的多態(tài)性可影響NK細胞及單核細胞的ADCC效能。有研究認為FcγRⅢa-158V較FcγRⅢa-158F與人IgG結(jié)合具有更高的親和力，可更有效介導(dǎo)ADCC作用，而具有更好的治療效果。有研究報道FcγRⅢa-158V/V基因型病人，通過MAb治療的療效較FcγRⅢa-158V/F及FcγRⅢa-158F/F基因型病人好。<

4、br>　　 由于臨床使用的腫瘤特異性MAb非常昂貴，其介導(dǎo)的ADCC抗腫瘤治療的病人在治療期間由于化療所致的骨髓抑制、合并感染等原因，往往需靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)及血漿，上述治療所提供的血清抗體和補體對ADCC抗腫瘤效應(yīng)的影響尚不十分清楚，深入研究在腫瘤特異性MAb治療應(yīng)用過程中IVIG和血漿的配合應(yīng)用十分重要。
　　 本試驗中嘗試使用nest-PCR的方法檢測出健康兒童及血液腫瘤患兒中FcγRⅢa的基因多態(tài)性的分布，

5、了解血液腫瘤患兒對MAb可能的療效反應(yīng)；通過體外實驗用利妥昔單抗介導(dǎo)不同F(xiàn)cγRⅢa基因型的NK細胞對高表達CD20的B細胞淋巴瘤細胞株(Raji細胞株)殺傷，確定不同F(xiàn)cγRⅢa基因型的NK細胞所介導(dǎo)ADCC效應(yīng)的差異；并通過增加補體及血清抗體的方式體外檢測它們對利妥昔單抗介導(dǎo)ADCC抗腫瘤作用影響。通過本研究希望對使用抗腫瘤特異性MAb的患者合理有效的應(yīng)用IVIG和血漿提供指導(dǎo)意見及實驗依據(jù)；這對提高腫瘤特異性MAb的臨床療效和改善

6、腫瘤患者的生存率具重大意義。
　　 第一部分、正常兒童及血液腫瘤患兒中FcγRⅢa基因多態(tài)性分布。
　　 目的：檢測健康兒童及血液腫瘤患兒中FcγRⅢa的基因多態(tài)性的分布，了解血液腫瘤患兒對MAb可能的療效反應(yīng)。
　　 方法：
　　 1.按照DNA提取試劑盒從收集的外周血標本中提取基因組DNA。
　　 2.巢式PCR(nest-PCR)擴增FcγRⅢa基因：
　　 (1)外側(cè)PCR：外側(cè)正

7、義引物A為5'TGG CAA AGG CAG GAA GTA TT 3'，外側(cè)反義引物B為5'GCG TGT AAG AAT CAG GAA TCT C 3'，25μL，反應(yīng)體系包括DNA模板3μL，正反義引物A、B各2pmol，10 mmoL/L dNTP 0.5μL，TaqDNA聚合酶1.5u，10×PCR緩沖液2.5μL。35個PCR循環(huán)(95℃ 45S，64℃ 45S，72℃ 30S)。擴增產(chǎn)物長度248 bp。
　　

8、(2)內(nèi)側(cè)PCR：內(nèi)側(cè)正義引物C為5'ATC AGA TTC GAT CCT ACT TCT GCAGGG GGC AT 3'，內(nèi)側(cè)反義引物D為5'ACG TGC TGA GCT TGA GTGATGGTG ATG TTC AC3'。25 μL反應(yīng)體系包括外側(cè)PCR擴增產(chǎn)物1μL，正反義引物C、D各025 pmol，10 mmol/L dNTP 0.5μL，TaqDNA聚合酶1.5u，10×PCR緩沖液2.5μL。35個PCR循環(huán)(95

9、℃ 45 S，65℃ 45 S，72℃ 30 S)。擴增產(chǎn)物長度94bp。
　　 3.NlaⅢ酶切鑒定FcγRⅢa基因多態(tài)性：8μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)NlaⅢ內(nèi)切酶酶切，于37℃酶切過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)15％PAGE電泳分離DNA片段，銀染顯色。FcγRⅢa-158V/V純合型：PCR-RFLP后可得到61 bp和33 bp兩個片段。FcγRⅢa-158 V/F雜合型：PCR-RFLP后可得到94 bp、61 bp和33 bp共3個片段

10、。FcγRⅢa-158 F/F純合型：PCR-RFLP后仍為94bp大小的片段。
　　 4.統(tǒng)計分析：數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，各組之間基因型分布差異及等位基因分布差異采用卡方檢驗，檢驗水準設(shè)α=0.05。
　　 結(jié)論：FcγRⅢa基因多態(tài)性在健康兒童及血液腫瘤患兒中的分布無明顯差異，均以FcγRⅢa-158V/F最多，F(xiàn)cγRⅢa-158V/V次之，F(xiàn)cγRⅢa-158F/F最少。
　　 第二部分、不

11、同F(xiàn)cγRⅢa基因型的NK細胞對Raji細胞的ADCC效應(yīng)的強度。
　　 目的：確定不同F(xiàn)cγRⅢa基因型的NK細胞所介導(dǎo)的ADCC效應(yīng)差異。
　　 方法：
　　 1.效應(yīng)細胞分離：采用Ficoll-Hapaque分離外周血單個核細胞，行ADCC實驗前流式細胞術(shù)檢測其中CD3-CD56+的NK細胞的表達，以及NK細胞上FcγRⅢ的表達率。
　　 2.靶細胞培養(yǎng)：高表達CD20的Raji細胞株作為靶細胞，行

12、ADCC實驗前流式細胞術(shù)檢測其CD20表達率。
　　 3.抗體：以利妥昔單抗作為ADCC反應(yīng)抗體。
　　 4.確定利妥昔單抗在下列ADCC實驗中的合適作用濃度：在預(yù)實驗中選用的利妥昔單抗的濃度分別為10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml等依次遞增，與Raji細胞37℃作用30分鐘后行分別用流式細胞術(shù)檢測Raji上的CD20的表達，以其接近為零表達時的利妥昔單抗的濃度為最合適的作用濃

13、度。
　　 5.不同F(xiàn)cγRⅢa基因型的NK細胞的ADCC實驗：取DIO標記的Raji細胞作為靶細胞，與利妥昔單抗于37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，再加入PBMNC作為效應(yīng)細胞，于體外37℃共孵育4小時，同樣再加入熒光標記PI上流式細胞術(shù)檢測，計算細胞毒性指數(shù)。
　　 6.統(tǒng)計分析：數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理，ADCC結(jié)果用均數(shù)±標準差表示，使用獨立樣本t檢驗(Independent-Samples T Test)

14、，檢驗水準設(shè)α=0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.在CD20+90％以上的Raji細胞1×106/ml中，30μg/ml的利妥昔單抗為最合適的體外實驗作用濃度。
　　 2.FcγRⅢa基因多態(tài)性可影響利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細胞對Raji細胞的體外ADCC效應(yīng)，以FcγRⅢa-158V/V基因型的NK細胞ADCC效應(yīng)最強，F(xiàn)cγRⅢa-158V/F基因型的NK細胞ADCC效應(yīng)次之。
　　 第三部分、血清抗體

15、及補體對利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細胞對Raji細胞殺傷作用的影響。
　　 目的：體外檢測血清抗體及補體對利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細胞對Raji細胞殺傷作用的影響。
　　 方法：
　　 1.效應(yīng)細胞、靶細胞及反應(yīng)抗體均與第二部分相同。
　　 2.血清補體準備：采外周血5ml于干燥無菌離心管中，斜放試管靜止30min后，2000rpm離心20min，用毛細吸管吸取上清(血清，含補體)-20℃冰箱保存，使用前與RPMI

16、1640培養(yǎng)液1∶1混合，制成含50％人血清(含補體)的培養(yǎng)基。
　　 3.血清抗體準備：采用上述方法分離血清，56℃水浴恒溫箱30min滅活(其中補體失活，而抗體仍保持其活性)，-20℃冰箱保存，使用前與RPMI1640培養(yǎng)液2∶3混合，制成含40％人血清(含IgG)的培養(yǎng)基。
　　 4.在行殺傷實驗前，檢測體外血清抗體對NK細胞上FcγRⅢa表達的影響。用含40％人血清(滅活后，含IgG約4.8mg/ml)的培養(yǎng)基將

17、PBMNC調(diào)成5×106/mL，取100μL，置于5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，拿出后PBS洗2次，流式細胞術(shù)檢測加入血清前后NK細胞上FcγRⅢa的表達。
　　 5.血清中抗體及補體對利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細胞對Raji細胞殺傷作用實驗：取DIO標記的Raji細胞作為靶細胞，與利妥昔單抗(同時在血清抗體組加入40％人滅活血清)，于37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，再加入PBMNC作為效應(yīng)細胞(同時在補體組加入50％人未滅

18、活血清)，于體外37℃共孵育4小時，再加入熒光標記PI上流式細胞術(shù)檢測，計算細胞毒性指數(shù)。
　　 6.統(tǒng)計分析：數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理， 殺傷結(jié)果用均數(shù)±標準差表示，使用多因素方差分析和獨立樣本的t檢驗，檢驗水準設(shè)α=0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.血清補體可增強利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細胞對Raji細胞殺傷作用。
　　 2.血清抗體會減弱利妥昔單抗介導(dǎo)的NK細胞對Raji細胞殺傷作用。