IGFBP-6對缺氧誘導性血管生成的作用研究.pdf

1、氧是多數(shù)生物體賴以生存的代謝原料,在物種生存的自然環(huán)境中,缺氧是一種常見的現(xiàn)象。為了適應缺氧環(huán)境,生物體進化出了一系列感知并應激環(huán)境缺氧的機制。血管生成便是其中一種。缺氧是血管生成的重要刺激因子。目前發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)缺氧參與的血管生成調控機制均為正反饋調節(jié)機制,即缺氧促進血管生成。而是否存在缺氧誘導性血管生成的負反饋調節(jié)機制,目前尚不清楚。
　　 IGF(insulin-like growth factor,胰島素樣生長因子)是體

2、內重要的生長因子,它在組織細胞的增殖、分化、凋亡,機體的生長發(fā)育及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調節(jié)作用。目前,大量的研究已經(jīng)證實了IGF系統(tǒng)參與血管生成的調控過程。IGF和胰島素在早期血管生成過程中起到應激或增強缺氧效應的作用。另一方面,IGF信號系統(tǒng)部分成員的基因表達也受缺氧調控。因此,本研究的目的之一是檢測在血管內皮細胞中基因表達受缺氧調控的IGF信號系統(tǒng)分子,特別是6個結合蛋白IGFBP-1～6。針對這一研究目的,我們以體外培養(yǎng)的大

3、鼠腦微動脈血管內皮細胞為材料,用半定量RT-PCR的方法發(fā)現(xiàn),大鼠腦微動脈血管內皮細胞僅表達6個結合蛋白中的IGFBP-6,且大鼠腦微動脈血管內皮細胞中IGFBP-6的基因表達受缺氧上調。我們以半定量RT-PCR以及實時熒光定量PCR的方法檢測了人類臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)IGFBP-6的表達情況,檢測結果證實HUVEC中IGFBP-6的基因表達同樣受缺氧上調。
　　 在以上初步研究結果的基礎上,我們從以下幾個方面進行了

4、深入研究:1)研究IGFBP-6基因表達受缺氧調控的機制;2)確定IGFBP-6在血管內皮細胞中表達的生理意義,即:IGFBP-6對于血管生成的調控作用;3)研究IGFBP-6影響血管生成的分子機制。
　　 研究方法包括:1)半定量RT-PCR和Real-Time PCR檢測物理缺氧及CoCl2模擬的化學缺氧對血管內皮細胞IGFBP-6表達模式的影響;2)序列分析IGFBP-6啟動子及增強子結構域內是否存在反式作用元件HRE及H

5、AS序列;3)采用體外血管生成模型,通過Malrigel實驗系統(tǒng)驗證體外重組IGFBP-6蛋白對血管生成的影響及其IGF配體依賴性;4)以轉基因斑馬魚flkl:gfp)為模型驗證IGFBP-6對于胚胎發(fā)育血管生成的影響;5)以異體移植實體瘤為腫瘤模型研究IGFBP-6對于腫瘤血管生成的影響;6)蛋白免疫印跡檢測HIF-1轉錄因子復合物的激活情況以及血管生成相關信號通路的激活情況;7)利用信號通路特異性抑制劑及體外血管生成模型找到IGFB

6、P-6抑制血管生成的信號通路。
　　 利用以上研究方法,我們發(fā)現(xiàn):1)缺氧上調血管內皮細胞中IGFBP-6的基因表達,而且缺氧對IGFBP-6基因表達的調控作用可能是通過缺氧誘導性轉錄因子HIF-1來實現(xiàn)的;2)IGFBP-6能夠抑制體外血管生成,這種抑制作用不依賴于IGFBP-6與IGF配體的結合;3)在體外血管生成模型中,IGFBP-6可以拮抗VEGF對血管生成的促進作用;4)在體內血管生成模型中,IGFBP-6既可以抑制斑