雞LDL受體RT-PCR分析以及腹脂和血漿生化指標(biāo)候選基因apo VLDL-Ⅱ基因和LPL基因的SNP篩查研究.pdf

1、脂蛋白是由脂肪和蛋白質(zhì)通過非共價(jià)結(jié)合形成的一種復(fù)合體，每一種脂蛋白都有其獨(dú)特的分子量、化學(xué)組成、濃度及生理功能。本試驗(yàn)分析了高脂安卡肉雞和低脂如皋黃雞腹脂、總膽固醇、甘油三酯和脂蛋白的濃度(HDL、LDL和VLDL)之間的關(guān)系；探討了LDL受體mRNA在高、低脂雞不同組織中的表達(dá)情況；主要對(duì)apo VLDL-Ⅱ基因、脂蛋白酶基因進(jìn)行了SNPs篩查及其與腹脂和血.漿生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析，同時(shí)分析了這兩個(gè)基因之間的互作效應(yīng)對(duì)腹脂和血漿生化指標(biāo)

2、的影響：基于SNPs的分析結(jié)果，對(duì)紅色原雞、文呂雞、絲羽烏骨雞、如皋黃雞和安卡肉雞群體進(jìn)行了遺傳分化研究，并構(gòu)建了這5個(gè)群體的系統(tǒng)發(fā)生樹。主要試驗(yàn)結(jié)果如下： 1.選用這兩個(gè)高、低脂雞品種的120個(gè)個(gè)體在同一條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，每2周記錄體重直至12周齡，測定腹脂性狀和I血漿生化指標(biāo)。結(jié)果表明，高脂雞的生長性能優(yōu)于低脂雞，公雞的生長速度快于母雞。高、低脂雞之間體重、腹脂重和腹脂率差異極顯著(P<0.001)，這些性狀在公、母之間差異也

3、極顯著(P<0.01)。高、低脂雞中腹脂與體重呈正相關(guān)，TCH和HDL水平差異極顯著(P<0.01)，公雞的TCH和LDL水平顯著高于母雞(P<0.01)。TCH濃度與HDL、LDL濃度呈正相關(guān)，甘油三酯濃度與HDL、VLDL濃度呈正相關(guān)。另外，在低脂雞中，腹脂與所有的生化指標(biāo)呈正相關(guān)，高脂雞中腹脂與TCH、LDL濃度正相關(guān)。 2.采用標(biāo)準(zhǔn)的Trizol法提取高、低脂雞腎、肝臟、小腸和腹脂的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，半定量分析不同組織中

4、RNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明,LDL受體在腹脂和肝臟中的表達(dá)差異顯著(P<0.05)。另外，LDL受體在高、低脂雞肝臟中的表達(dá)差異顯著(P<0.05)。高脂雞肝臟LDL受體的表達(dá)量與腹脂重呈負(fù)相關(guān)，低脂雞肝臟LDL受體的表達(dá)量與總膽固醇濃度、甘油三酯濃度、脂蛋白濃度、腹脂重及腹脂率呈負(fù)相關(guān)。 3.運(yùn)用PCR-RFLP、PCR-SSCP及測序技術(shù)檢測突變位點(diǎn)。根據(jù)apo VLDL-Ⅱ基因組序列共設(shè)計(jì)17對(duì)引物，在5個(gè)雞群體中，只有5

5、對(duì)引物檢測到多態(tài)，共檢測到6處突變。分別為：1950 bp(G/A)、2532 bp(T/A)、2706 bp(A/C)、2793 bp(C/T)、4436 bp(T/C)、4473 bp(T/G)。檢測到的突變中有4個(gè)位于基因的非編碼區(qū)，2個(gè)位于外顯子4內(nèi)。卡方適合性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，群體間在引物VLDL9和VLDL17對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上基因頻率差異顯著。如皋黃雞引物VLDL17對(duì)應(yīng)不同的基因型與腹脂顯著相關(guān)(P<0.05)，高低脂雞中引物VLD

6、L6、VLDL9、VLDL10對(duì)應(yīng)的不同基因型與腹脂顯著相關(guān)(P<0.05)。高脂雞中引物VLDL9對(duì)應(yīng)的不同基因型與甘油三酯及vLDL濃度顯著相關(guān)，低脂雞中引物VLDL9對(duì)應(yīng)的不同基因型與甘油二酯及VLDL濃度顯著相關(guān)。另外，對(duì)高、低脂雞的分析表明，引物VLDL9及VLDL17對(duì)應(yīng)的基岡型與甘油酯、極低密度脂蛋白濃度顯著相關(guān)，引物VLDL10對(duì)應(yīng)的基因型與總膽固醇、高密度脂蛋白濃度顯著相關(guān)(P<0.05)。因此，可以認(rèn)為，在引物VLD

7、L9上AA型純合子個(gè)體的體重、腹酯重、甘油三酯及VLDL水平顯著高于其它基因型(P<0.05)，引物10對(duì)應(yīng)的雜合子個(gè)體的體重、腹脂重顯著低于其它基因型(P<0.05)，總膽固醇和高密度脂蚩白水平顯著高于其它基因型(P<0.05)。 4.根據(jù)基因組序列設(shè)計(jì)11對(duì)引物擴(kuò)增脂蛋白酶基因，其中位于內(nèi)含子8的2對(duì)引物L(fēng)PL9、LPLl0檢測到多態(tài)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP突變，分別為14538bp(C/A)、14977 bp(T/C)。結(jié)果表明，在引物L(fēng)

8、PL10對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)上，如皋黃雞群體等位基因頻率的哈代-溫伯格檢驗(yàn)不平衡(P<0.01)。安卡肉雞中，引物L(fēng)PL10對(duì)應(yīng)的不同基因型間的腹脂性狀差異顯著(P<0.05)，高、低脂兩個(gè)群體內(nèi)引物L(fēng)PL9、LPL10分別對(duì)應(yīng)的不同基因型個(gè)體間的腹脂重差異顯著(P<0.05)。另外，安卡肉雞引物L(fēng)PL9對(duì)應(yīng)的基因型與LDL水平顯著相關(guān)(P<0.05)，高低脂雞引物L(fēng)PL10對(duì)應(yīng)的不同基因型之間總膽固醇、高密度脂蛋白的含量存在顯著差異(P<0.0

9、5)。 5.基因型的互作分析結(jié)果表明，LPL基因CC純合子個(gè)體的腹脂重顯著高于TT純合子個(gè)體(P<0.05)，而在apo vLDL-Ⅱ基因?qū)?yīng)的基因型之間結(jié)果相反。2個(gè)基因的互作分析表明，具LPL基因的TT純合子與apo VLDL-Ⅱ基因TT純合子組合(TTTT)的個(gè)體的腹脂重顯著高于LPL基因的TT純合子與apo VLDL-Ⅱ基因TC雜合子組合(TTTC)的個(gè)體(P<0.05)，LPL基因的TC純合子與apo vLDL-Ⅱ基因

10、TT雜合子組合(TCTT)個(gè)體的腹脂重顯著高于雙純合子TTCC個(gè)體，雙純合子CCTT個(gè)體的腹脂顯著高于CCTC個(gè)體(p<0.05)。LPL基因的TT個(gè)體的總膽固醇和高密度脂蛋白水平顯著高于CC基因型的個(gè)體(P<0.05)；apo VLDL-Ⅱ基因雜合子個(gè)體的總膽固醇和高密度脂蛋白水平顯著高于TT純合子個(gè)體(P<0.05)。LPL基因與apoVLDL-Ⅱ基因組合基因型TTTT個(gè)體的總膽固醇和高密度脂蛋白水平顯著低于TTTC個(gè)體(P<0.0

11、5)，TCTT個(gè)體的甘油三酯和極低密度脂蛋白水平顯著低于TCTC個(gè)體(P<0.05)。另外，CCTT個(gè)體的高密度脂蛋白水平低于CCTC個(gè)體(P<0.05)。因此，apo VLDL-Ⅱ基因及LPL基因可作為腹脂和血漿膽固醇濃度的候選基因。 6.基于紅色原雞、如皋黃雞、安卡肉雞、文昌雞和絲羽烏骨雞SNPs的分析結(jié)果，估測群體間的遺傳分化并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。對(duì)于apo VLDL-Ⅱ基因而言，安卡肉雞的遺傳多樣性最豐富，而對(duì)于LPL基因，

12、絲羽烏骨雞的多樣性最豐富?？紤]到2個(gè)基因的互作，安卡肉雞的多樣性最高，文昌雞最低。對(duì)所有的群體而言，LPL基因的多態(tài)性高于apo VLDL-Ⅱ基因。apoVLDL-Ⅱ基因中紅色原雞的有效等位基因數(shù)最高，而LPL基因中絲羽烏骨雞的有效等位基因數(shù)最高。LPL基因所有的位點(diǎn)上的平均總遺傳多樣度及群體內(nèi)的遺傳多樣度均高于apo VLDL-Ⅱ基因，而apo VLDL-Ⅱ基因所有位點(diǎn)的遺傳分化系數(shù)較高，表明群體間的變異程度較高。所有位點(diǎn)上的總遺傳多

13、樣度的期望值高于群體內(nèi)的遺傳多樣度。所有位點(diǎn)上的平均遺傳分化系數(shù)為0.194，這表明19.4％的遺傳差異是由品種間的差異引起的，而剩余的80.6％是由個(gè)體間的差異造成的。LPL基因5個(gè)群體所有位點(diǎn)上的平均基因流高于apo VLDL-Ⅱ基因。高低脂雞種LPL基因及apo VLDL-Ⅱ基因遺傳一致度和遺傳距離的估測結(jié)果差異顯著，安卡肉雞(高脂)與絲羽烏骨雞及如皋黃雞(低脂)的遺傳距離最高。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹也同樣表明，文昌雞和紅色原雞的親緣關(guān)