Twist基因RT-PCR方法的建立和PAB-Gal4-DBD-HA-twist重組質粒的制備.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分、Twist基因RT-PCR方法的建立 目的：Twist是胚胎發(fā)育相關基因，編碼一種在胚胎發(fā)育中起關鍵調控作用的轉錄因子，在誘導細胞移動及組織塑型中起重要作用。新近發(fā)現(xiàn)twist具有癌基因的特征，在人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、愈后、復發(fā)中具有重要作用，在人類多種惡性腫瘤中高表達，在正常組織和惡性程度低的癌細胞中無或極低表達。Twist—因GC含量高（75%），局部區(qū)域GC含量高達90％以上，有連續(xù)的

2、30個GC（NM—000474），具有復雜的二級結構，其逆轉錄聚合酶鏈式反應（Reverse transcription polymerase chain，RT—PCR）方法的建立是一項相當困難而又費力費時的工作。本課題以腎癌細胞系786—0、肝癌細胞系HepG2、胃癌細胞系MNK和人正常乳腺細胞系Hs578Bst為研究對象，建立twist基因的RT—PCR方法，為探討twist在腫瘤尤其在腎癌中的作用機制奠定方法學基礎。 方法

3、：蘇復液氮凍存的腎、肝、胃癌細胞和正常乳腺細胞株，加入RPMI1640液培養(yǎng)（含10%的小牛血清），置于CO2培養(yǎng)箱中（5%CO2、95%空氣、37℃）培養(yǎng)，24h更換培養(yǎng)液，以后每2～3 d更換一次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶底時傳代或提取RNA。用RNA simple Total RNA kit提取細胞內總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計定量檢測濃度、純度。cDNA合成按照Qu

4、antscript RT kit Quant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作合成。PCR擴增所用引物設計根據(jù)GeneBank中的TW/ST（NM_000474）基因序列，運用Primer5.0引物軟件并結合Olig06.0的評價分析，最后經(jīng)Blast檢索以確保每條引物與基因庫人類已知的其它基因無同源性，同時以GAPDH為內參照基因并設計其引物。PCR擴增操作按照TAKARA公司的LA Taq with GC Buffer PCR試劑

5、盒說明書，設置PCR反應體系并優(yōu)化擴增反應條件，擴增產物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳后，照相保存。 結果：（1）總RNA的質量：提取的總RNA通過紫外分光光度計測量，A260/A280在1.80～2.10之間，A260/A2301.90～2.20之間，濃度大于300 ng/μl，通過1%瓊脂糖凝膠電泳后，28S帶比18S帶明顯，灰度比大于1，無拖尾；（2）采用TAKARA的LA Taq with GC buffer PCR試劑盒，通

6、過PCR方案的優(yōu)化，在腎癌細胞系786—0、肝癌細胞系HepG2和胃癌細胞系MNK中均擴增出twist基因的特異表達帶。 結論：（1）成功摸索出了具有復雜二級結構、富含GC的twist基因的RT—PCR擴增方法；（2）RT—PCR結果顯示在腎癌細胞系中存在twist基因的特異表達。 第二部分、PAB-Gal4-DBD-HA-Twist重組質粒的制備 目的：TWIST蛋白是一種在胚胎發(fā)育中起關鍵調控作用的轉錄因子，

7、屬于堿性的螺旋一環(huán)一螺旋（bHLH）蛋白家族成員，在不同的種屬之間其核苷酸和氨基酸序列高度保守，其能與DNA上E—BOX的5’—CANNTG—3’序列結合并且能借助HLH形成特定的同源或異源二聚體，廣泛參與調控器官生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細胞增殖分化等過程，并賦予細胞遷移的能力，還能介導上皮細胞一間葉細胞的轉變（Epithelial—Mesenchymal transition，EMT）及細胞的遷移，是上皮間質變過程中的重要調控因子。本實驗

8、擬采用PCR和分子克隆技術，構建人Twist基因的表達載體pAB—Ga14—DBD—HA—Twist，為進一步研究其轉錄調控作用提供實驗工具。 方法：（1）設計帶有酶切位點BamHⅠ和HindⅢ的特異引物，對重組克隆質粒pcDNA—Flag—Twist進行PCR擴增，得到含有酶切位點的Twist基因編碼區(qū)全長序列：（2）對含有酶切位點的Twist基因全長片段和pAB—Ga14—DBD—HA表達載體進行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切

9、反應，電泳分離，膠回收純化后，進行連接反應；（3）將連接反應產物轉入感受態(tài)大腸桿菌中，過夜培養(yǎng)；（4）菌落PCR，提取陽性重組質粒作限制性內切酶分析和序列測定。 結果：（1）限制性核酸內切酶酶切鑒定表明，構建的重組質粒中含有與Twist基因編碼區(qū)全長一致的650 bp片段；（2）DNA測序結果經(jīng)BLAST分析顯示：與GenBank數(shù)據(jù)庫twist基因（NM_000474）序列完全一致，同源性為100%。 結論：成功構建了