RNA干擾阻斷TGFβ1對人顳動脈炎的影響及其機制.pdf

1、第一章 TGFβ1基因RNAi質粒載體的構建與鑒定 目的：構建人TGFβ1基因的RNAi質粒載體，為進一步構建其RNAi病毒載體奠定基礎。 方法：根據人TGFβ1的mRNA序列選擇3個靶序列并根據它們設計合成3對寡核苷酸序列，同時合成1對陰性對照寡核苷酸序列；將以上4對寡核苷酸序列退火后連入pRNA-U6.2/Lenti質粒并分別命名為pRNA-U6.2/Lenti-1，pRNA-U6.2/Lenti-2，pRNA-U6

2、.2/Lenti-3，pRNA-U6.2/Lenti-4。酶切和測序鑒定后，將以上重組質粒轉染Hela細胞，運用RT-PCR和ELISA檢測TGFβ1mRNA和蛋白的表達水平。 結果：酶切和測序證實目的寡核苷酸片段已被準確克隆到pRNA-U6.2/Lenti質粒；與對照組相比，pRNA-U6.2/Lenti-1，pRNA-U6.2/Lenti-2轉染Hela細胞后，TGFβ1 mRNA水平及蛋白水平的表達量均受到明顯抑制；其中T

3、GFβ1蛋白水平在pRNA-U6.2/Lenti-1組下降79.2％，在pRUA-U6.2/Lenti-2組下降53.7％，統(tǒng)計有顯著性差異(P<0.01)。 結論：成功構建了人TGFβ1基因的RNAi質粒載體，為進一步構建其RNAi病毒載體奠定了基礎。 第二章 IGFβ1基因RNAi慢病毒載體的構建與鑒定 目的：構建TGFβ1基因RNAi慢病毒載體，為因TGFβ1高表達而致病疾病的基因治療奠定基礎。 方

4、法：將第一章實驗得到的最有效的干擾質粒pRNA-U6.2/LeNti-1和陰性對照質粒pRNA-U6.2/Lenti-4分別與包裝質粒混合物共轉染293FT細胞，包裝產生病毒載體顆粒。各組病毒載體轉染Hela細胞后，運用Real-Time PCR和ELISA檢測TGFβ1mRNA和蛋白的表達水平。 結果：各pRNA-U6/Lenti質粒與包裝質粒共轉染293FT細胞后能產生高滴度的慢病毒載體顆粒；慢病毒載體感染Hela細胞后，p

5、RNA-U6.2/Lellti-1可以顯著地抑制TGFβ1 mRNA水平及蛋白水平的表達，其中TGFβ1蛋白水平在pRNA-U6.2/Lenti-組下降90.7％，統(tǒng)計有顯著性差異(P<0.01)；陰性對照病毒pRNA-U6.2/Lenti-4對TGFβ1 mRNA水平及蛋白水平無明顯影響。 結論：成功構建了人TGFβ1基因RNAi慢病毒載體，為后續(xù)的針對人顳動脈炎的干預研究提供了良好的實驗工具。 第三章 RNAi阻斷T

6、GFβ1對人顳動脈炎的影響及其機制 目的：觀察RNAi慢病毒載體pRNA-U6.2/Lenti-1阻斷TGFβ1表達對人顳動脈炎的影響并探討其可能機制。 方法：將經病理活檢確診為顳動脈炎的每一例人顳動脈標本(共12例)平均分成4份，分別埋入4只SCID鼠腹部皮下，建立人顳動脈炎-嚴重聯(lián)合免疫缺陷病小鼠嵌合體模型；模型隨機分為對照組、pRNA-U6.2/Lenti-1干預組、地塞米松干預組、聯(lián)合干預組(pRNA-U6.2/

7、Lanti-1聯(lián)合地塞米松)。對照組于皮下顳動脈處注射生理鹽水(100ul)；pRNA-U6.2/Lenti-1干預組于皮下顳動脈處注射針對TGFβ1的RNAi慢病毒載體pRNA-U6.2/Lenti-1(100ul，滴度3.1×107TU/ml)；地塞米松干預組于皮下顳動脈處注射地塞米松(4mg/kg)；聯(lián)合治療組于皮下顳動脈處注射pRNA-U6.2/Lenti-1(100ul，滴度3.1×107TU/ml)及地塞米松(4mg/kg)

8、，干預3周后獲取顳動脈標本，采用光鏡觀察干預后各組人顳動脈炎的炎癥細胞浸潤程度及內膜增生程度的變化。運用免疫組化、RT-PCR、Western-blotting分別觀察各組炎性顳動脈干預后TGFβ1、PCNA、NF-KB、IL-2、MCP-1、ICAM-1、在mRNA及蛋白水平的變化。 結果：1.與對照組相比，慢病毒載體pRNA-U6.2/Lenti-1干預后炎性顳動脈內膜增生程度減輕(P<0.05)；RT-PCR檢測TGFβ1

9、、PCNA、NF-KB、IL-2在mRNA水平表達下降，Western-blotting檢測TGFβ1、PCNA、NF-KB、IL-2在蛋白水平表達下降(P<0.05)。 2.與對照組相比，地塞米松干預后炎性顳動脈炎性細胞浸潤程度減輕(P<0.05)；RT-PCR檢測MCP-1、ICAM-1、NF-KB、IL-2在mRNA水平表達下降，Western-blotting檢測MCP-1、ICAM-1、NF-KB、IL-2在蛋白水平表

10、達下降(P<0.05)。 3.pRNA-U6.2/Lenti-1及地塞米松聯(lián)合干預后，炎性顳動脈炎性細胞浸潤程度較對照組減輕(P<0.05)；炎性顳動脈內膜增生程度較對照組及pRNA-U6.2/Lenti-1干預組均減輕(P<0.05)。與對照組比較，TGFβ1、PCNA、MCP-1、ICAM-1、NF-KB、IL-2在mRNA及蛋白水平表達均下降(P<0.05)；與pRNA-U6.2/Lenti-1干預組比較，PCNA在mRN

11、A水平及蛋白水平均下降(P<0.05)。 結論：1.慢病毒載體pRNA-U6.2/Lenti-1干預后，可能通過抑制TGFβ1進一步抑制平滑肌細胞增殖，使炎性顳動脈內膜增生程度減輕；此病毒載體聯(lián)合地塞米松干預后，對平滑肌細胞的增殖可能產生協(xié)同抑制作用，更有利于減輕炎性顳動脈內膜增生程度。 2.TGFβ1不是致顳動脈炎性細胞浸潤的主要因素，因此慢病毒載體piCA-U6.2/Lellti-1治療后，不能明顯減輕顳動脈炎性細胞