鼻咽癌臨床進(jìn)展過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子活性譜動(dòng)態(tài)變化規(guī)律研究.pdf

1、研究背景：
　　 鼻咽癌是一種多步驟進(jìn)展的多基因遺傳性惡性腫瘤。目前，己發(fā)現(xiàn)鼻咽癌中越來(lái)越多的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)分子改變，并且癌基因過(guò)表達(dá)或活性過(guò)高以及抑癌基因的表達(dá)缺失或失活可發(fā)生在不同臨床/病理進(jìn)展階段。我們實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)多年的研究，發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)候選抑瘤/易感基因參與多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路，并與鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。重要的是，這些基因表達(dá)缺失或失活同樣也發(fā)生在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的不同階段。上述研究表明，許多參與信號(hào)通路

2、的遺傳分子(尤其是組織特異性)相繼激活或失活導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的活性以及所調(diào)控的靶基因表達(dá)異常，從而促進(jìn)了鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展。因此，基因異常表達(dá)譜與異常的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式密切相關(guān)。
　　 轉(zhuǎn)錄因子是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要分子。它接受上游信號(hào)通路異常信號(hào)，引起基因的表達(dá)紊亂，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。了解轉(zhuǎn)錄因子活性在腫瘤進(jìn)展中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律有利于闡明基因調(diào)控和表達(dá)異常的分子機(jī)制。盡管已有文獻(xiàn)報(bào)道了某些轉(zhuǎn)錄因子在鼻咽癌組織或細(xì)胞中存在異常表達(dá)或

3、活性改變，但是系統(tǒng)闡述轉(zhuǎn)錄因子活性在鼻咽癌不同臨床進(jìn)展階段動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的研究尚無(wú)人問(wèn)津。從而，本研究采用轉(zhuǎn)錄因子芯片分別檢測(cè)和分析鼻咽癌不同臨床進(jìn)展階段轉(zhuǎn)錄因子活性動(dòng)態(tài)變化規(guī)律以及鼻咽癌細(xì)胞系與正常鼻咽上皮細(xì)胞系活性差異轉(zhuǎn)錄因子。
　　 鼻咽癌不同臨床進(jìn)展階段動(dòng)態(tài)變化的轉(zhuǎn)錄因子活性譜的構(gòu)建
　　 對(duì)鼻咽癌不同臨床進(jìn)展階段的組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析轉(zhuǎn)錄因子活性在臨床進(jìn)展中的動(dòng)態(tài)變化。組織樣本分為兩組：1.獨(dú)立樣本組(12例)

4、，每例樣本單獨(dú)提取核蛋白，分別進(jìn)行芯片檢測(cè)；2.混合樣本組(13例)，同一臨床階段的樣本混合，提取核蛋白后進(jìn)行芯片檢測(cè)。抽提臨床Ⅰ-Ⅳ期組織核蛋白后，用Combo Protein/DNA芯片(含有345個(gè)檢測(cè)位點(diǎn))檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子活性。采用One-way ANOVA和studentt檢驗(yàn)方法獲得55個(gè)差異轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)26個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在獨(dú)立樣本組和混合樣本組中的活性變化趨勢(shì)基本一致。這些轉(zhuǎn)錄因子在鼻咽癌臨床進(jìn)展階段中活性增高并且呈

5、動(dòng)態(tài)性的變化。
　　 AP2和ATF家族分子在鼻咽癌不同臨床進(jìn)展階段的表達(dá)分析
　　 通過(guò)線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)在26個(gè)活性增高的轉(zhuǎn)錄因子中，16個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與鼻咽癌臨床進(jìn)展呈正相關(guān)性。這些轉(zhuǎn)錄因子分別是GAS/ISRE，CdxA/NKX2，HOXD8，PPUR，NFкB，AP2，F(xiàn)ra-1/JUN，AP3，PTF1，GKLF，ATF/CREB，RFX，C/EBP，Snail，PRDI-BFc和Stat5b。許多文獻(xiàn)提示，AP

6、2和ATF家族分子與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。因此，我們選擇這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行驗(yàn)證和分析。首先用EMSA證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子AP2和ATF的活性變化規(guī)律，進(jìn)而擴(kuò)大樣本進(jìn)一步對(duì)這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族的主要分子AP2α、AP2β、AP2γ、ATF1和ATF2以及靶基因EGFR和MMP-2進(jìn)行免疫組化分析。采用Spearman’s ranktest和Fisher's exact test分析轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)與鼻咽癌臨床進(jìn)展階段和靶基因表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，AP

7、2α、AP2β、AP2γ、ATF1和ATF2在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常鼻咽上皮，且與臨床進(jìn)展相關(guān)。AP2α與靶基因EGFR、ATF1和ATF2與靶基因MMP-2之間的表達(dá)具有相關(guān)性。Western blot和RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了以上結(jié)果。
　　 鼻咽癌細(xì)胞系活性差異轉(zhuǎn)錄因子分析
　　 采用博奧生物技術(shù)有限公司的轉(zhuǎn)錄因子芯片(含有270個(gè)檢測(cè)位點(diǎn))檢測(cè)正常鼻咽上皮細(xì)胞系(NP69)、非轉(zhuǎn)移性(6—10B)和轉(zhuǎn)移性(

8、5-8F)鼻咽癌細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄因子活性。通過(guò)比較信號(hào)值，獲得差異轉(zhuǎn)錄因子。鼻咽癌細(xì)胞中有10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)，8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)。值得注意的是，在上調(diào)的10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中，AP2， ATF/CREB，C/EBP和RFX與鼻咽癌組織的分析結(jié)果一致。與正常鼻咽上皮比較，它們?cè)诒茄拾┙M織中表達(dá)上調(diào)且與臨床階段的進(jìn)展相關(guān)。與NP69相比，AP2，ATF/CREB和Sp1的活性在兩株鼻咽癌細(xì)胞中明顯升高，EMSA分析進(jìn)一步證實(shí)了芯片結(jié)果。RT-PCR和

9、Western blot分析結(jié)果表明，AP2α、AP2β、AP2γ、ATF1、ATF2、Sp1和Sp3 mRNA表達(dá)水平在鼻咽癌細(xì)胞明顯上調(diào)，其中 AP2α、AP2γ、ATF1、ATF2、Sp1和Sp3蛋白水平在5-8F細(xì)胞高于6-10B細(xì)胞。此外，我們發(fā)現(xiàn)Sp1、Sp3以及Sp1靶基因VEGF和MMP-9在鼻咽癌組織高表達(dá)。
　　 Sp1對(duì)5-8F細(xì)胞侵襲能力的影響
　　 為了明確Sp1對(duì)5-8F細(xì)胞侵襲能力的影響，使

10、用Sp1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞以干預(yù)Sp1的表達(dá)。Sp1 siRNA能顯著下調(diào)5-8F細(xì)胞中Sp1的蛋白水平以及VEGF表達(dá)和MMP-9分泌。同時(shí)，用光輝霉素(一種Sp1特異性的抑制劑)處理5-8F細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)光輝霉素能夠呈劑量依賴性地抑制Sp1、VEGF和MMP-9的表達(dá)，同時(shí)5-8F細(xì)胞遷移和侵襲能力降低。這表明Sp1表達(dá)和活性增高而引起MMP-9和VEGF的過(guò)表達(dá)，可能是5-8F細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)的重要原因之一。
　　

11、綜上所述，鼻咽癌不同臨床階段進(jìn)展過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子活性動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的研究為我們進(jìn)一步探索鼻咽癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了有價(jià)值的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。盡管目前我們得到了一些與臨床進(jìn)展相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其活性變化模式，但這并不代表我們揭示了所有與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高通量的Protein/DNA芯片分析的確揭示了部分差異轉(zhuǎn)錄因子的活性變化規(guī)律，而這些轉(zhuǎn)錄因子在鼻咽癌進(jìn)展過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律可能與異常的基因表達(dá)譜密切相關(guān)。隨著系