特異性抑制Tim-1表達的siRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建和Tim家族分子在小鼠肝炎模型中表達的初步研究.pdf

1、目的：首先構(gòu)建帶HA標簽的Tim-1真核表達載體和針對Tim-1的具有良好抑制作用的siRNA表達載體。其次通過real-time PCR的方法初步研究Tim家族分子在ConA誘導的小鼠急性肝炎模型和HBV全基因轉(zhuǎn)基因鼠中的表達水平。該實驗不僅為進一步研究Tim家族分子在免疫系統(tǒng)中的作用提供新的實驗工具，而且為下一步研究Tim家族分子在肝臟炎癥疾病中的作用機制奠定基礎(chǔ)。方法： 1.Tim-1HA融合蛋白在肝癌細胞系HepG2中的

2、表達 以小鼠脾細胞eDNA為模板，設(shè)計引物，PCR擴增Tim-1HA融合蛋白基因片段，T-A克隆入真核表達載體pTARGE-T，構(gòu)建重組表達載體pTARGETim-1HA。重組子經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定。將重組子以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2，RT-PCR和Western blot的方法檢測Tim-1HA融合蛋白表達。 2.針對Tim-1的siRNA表達載體的構(gòu)建及其對Tim-IHA的抑制效果 參考

3、siRNA的設(shè)計策略，通過基因Blast，設(shè)計并合成4對針對Tim-i cDNA序列的寡核苷酸，退火后克隆入含有U6啟動子的pAVU6+27載體，構(gòu)建針對Tim-1的siRNA表達載體，重組子經(jīng)酶切及測序鑒定。將真核表達載體pTARGETim-1HA與4個siRNA表達載體分別共轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2細胞。轉(zhuǎn)染72小時后，利用RT-PCR和Western blot的方法檢測siRNA對Tim-l的抑制效果。 3．制備ConA誘

4、導的小鼠急性肝炎模型 小鼠尾靜脈注射ConA 25mg/Kg體重制備急性肝炎模型，以尾靜脈注射生理鹽水小鼠為對照鼠，6～8小時后處死小鼠，測定小鼠血清ALT水平，取部分肝組織切片進行HE染色。 4.實時定量PCR測定Tim分子在模型中的表達根據(jù)SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)試劑盒說明測定不同模型小鼠肝組織中Tim-1、Tim-2和Tim-3 mRNA水平的表達，并進行熔解

5、曲線分析，利用最低循環(huán)數(shù)值(Ct)比較法檢測Tim家族基因的表達。 結(jié)果： 1．真核表達載體pTARGETim-IHA的構(gòu)建及其在肝癌細胞系HepG2中的表達 抽提小鼠脾細胞mRNA，利用RT-PCR的方法獲得長度為967bp的Tim-IHA基因片段，T-A克隆入pTARGET，構(gòu)建重組真核表達載體pTARGETim-IHA，經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析和PCR檢測初步提示重組子中Tim-IHA以全長并且正向插入

6、pTARGET載體。測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了可表達Tim-lHh融合蛋白的真核表達載體pTARGETim-IHA。重組子DNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，RT-PCR和Western b10t分別檢測到Tim-1HA在mRNA和蛋白質(zhì)水平上有表達。 2．針對Tim-I siRNA表達載體的構(gòu)建及其對Tim-IHA的抑制效果 設(shè)計并合成針對Tim-1 cDNA序列的寡核苷酸片斷，克隆入pAVU6+27載體上u6啟動子下游2

7、7bp后，經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析和測序證明成功構(gòu)建了針對Tim-1的siRNA表達載體。真核表達載體pTARGETim-IHA與siRNA表達載體共轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2。轉(zhuǎn)染72h后，RT-PCR結(jié)果表明在mRNA水平，siRNA表達載體可抑制Tim-1HA的表達，實驗組與陰性對照組之間的Tim-IHA的水平均不同。Western blot檢測證實其在蛋白質(zhì)水平上亦有良好抑制效果。 3．成功制備小鼠ConA急性肝炎模型

8、 小鼠C0nA急性肝炎模型血清ALT水平為334±40 U/L，顯著高于對照組小鼠(41±15U/L)。光鏡下觀察可見肝細胞變性，肝內(nèi)大量淋巴細胞浸潤，可見點、灶狀壞死，生理鹽水注射小鼠肝組織未見任何變化。 4．實時定量PCR分析不同小鼠肝組織Tim-1、Tim-2和Tim-3的表達 利用最低循環(huán)數(shù)值(ct)比較法檢測目的基因的表達，結(jié)果表明在ConA急性肝炎模型小鼠肝組織中Tim-l及Tim-3表

9、達升高，而Tim-2表達水平低于生理鹽水對照鼠。HBV轉(zhuǎn)基因鼠Tim-3表達水平顯著高于同品系對照鼠，Tim-2表達較對照降低。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建可表達Tim-1HA融合蛋白的真核表達載體，并首次將RNAi技術(shù)應(yīng)用于Tim家族分子的研究，成功構(gòu)建有效抑制Tim-1表達的siRNA表達載體，為進一步研究Tim家族分子在免疫系統(tǒng)中的作用提供新的實驗工具。 2．首次利用實時定量PCR的技術(shù)檢測Tim家族分子在Con