血小板活化因子對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Src抑制的蛋白激酶C底物基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：研究血小板活化因子（PAF）對(duì)培養(yǎng)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RPMVEC）中Src抑制的蛋白激酶C底物（SSeCKS）mRNA表達(dá)的影響，觀察信號(hào)通路抑制劑對(duì)炎癥介導(dǎo)SSeCKS mRNA表達(dá)的干預(yù)作用，結(jié)合我們既往的工作進(jìn)一步探討PAF參與急性肺損傷（ALI）發(fā)生的機(jī)制，并初步開展SSeCKS在炎癥誘導(dǎo)RPMVEC損傷過程中基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)RPMVEC；建立RPMVEC中SSeCKS

2、mRNA表達(dá)的原位雜交檢測(cè)方法；根據(jù)PAF刺激時(shí)間和濃度的差異將RPMVEC隨機(jī)分為PAF量效組和時(shí)效組：量效組分別以10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L PAF與RPMVEC作用 1.5h，時(shí)效組以10-7 mol/L PAF與RPMVEC分別作用0.5、1.5、3、6、12、24 h；信號(hào)通路抑制劑干預(yù)：RPMVEC與10 μmol/L核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制劑吡咯烷二巰

3、基氨甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）預(yù)孵育1 h或10 μmol/L蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）抑制劑雙吲哚基順丁烯二酰亞胺（bis-indolylmaleimide，BIM）預(yù)孵育0.5h，再與10-7 mol/L PAF或10 mg/L脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作用1.5h，以上均設(shè)正常、陰性和陽性對(duì)照組；原位雜交技術(shù)（in situ hy

4、bridization，ISH）與計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)軟件結(jié)合運(yùn)用檢測(cè)不同條件下RPMVEC中SSeCKS mRNA的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：⑴體外成功進(jìn)行RPMVEC的分離培養(yǎng)，并經(jīng)形態(tài)學(xué)及FITC-BSI結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)。⑵成功建立經(jīng)地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針原位雜交檢測(cè)RPMVEC中SSeCKS mRNA的實(shí)驗(yàn)方法。⑶正常RPMVEC有 SSeCKS mRNA少量表達(dá)，為棕黃色細(xì)顆粒狀雜交信號(hào)，分布于胞質(zhì)。10-10、10-9、1

5、0-8、10-7 mol/L PAF分別孵育RPMVEC 1.5h，SSeCKS mRNA表達(dá)量隨其濃度增加而逐漸升高，與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10-7 mol/L PAF刺激RPMVEC 0.5h，SSeCKS mRNA表達(dá)水平即顯著升高，1.5h達(dá)峰值，之后逐漸下降，至24 h仍高于正常對(duì)照組。⑷PDTC可顯著下調(diào)PAF或LPS對(duì)RPMVEC中SSeCKS mRNA的誘導(dǎo)效應(yīng)，而BIM對(duì)此效應(yīng)無干預(yù)作用。