鉤吻素子抗神經(jīng)病理性疼痛作用與脊髓神經(jīng)活性甾體別孕烯醇酮的關系.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic Pain,NPP)是由軀體感覺系統(tǒng)損傷或病變引起的疼痛綜合癥,以自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏為特征。NPP發(fā)病率高,困擾著數(shù)以千萬計的患者。NPP疼痛劇烈,藥物治療是其主要治療手段,但目前臨床上治療藥物療效不佳、毒副作用大,亟待研發(fā)具有新治療靶標與作用途徑的新型防治藥物。
　　從藥用植物中尋找抗NPP活性成分并深入進行相關的關鍵科技問題探索研究是創(chuàng)制新型抗NPP藥物的重要途徑。鉤吻(Gel

2、semium elegans Benth)為馬錢科植物胡蔓藤的全草,是歷史悠久的藥用植物。國產(chǎn)鉤吻的主要有效成分為吲哚類生物堿,其中鉤吻素子(koumine,KM)為其含量最高且毒性較低的一種有效成分,屬于單萜吲哚生物堿,分子式C20H22N2O,分子量為306.3。大小鼠坐骨神經(jīng)慢性束縛損傷(chronic constriction injury,CCI)模型和脊神經(jīng)結扎(spinal nerve ligation,SNL)模型為公認

3、的經(jīng)典外周NPP動物模型。本課題組新近在大鼠CCI模型和大鼠SNL模型上,以熱輻射痛閾、機械刺激痛閾和自發(fā)性痛行為為指標,首次觀察到鉤吻素子具有顯著的抗NPP作用,有效劑量遠低于中毒劑量,因此鉤吻素子可能具有治療NPP的應用價值。
　　然而,鉤吻素子抗NPP作用的機制有待于探索。外周NPP的發(fā)生機制包括外周機制和中樞機制,其中脊髓背角是外周NPP的重要調控部位。近年來日益重視神經(jīng)活性甾體在NPP發(fā)生中的調控作用。別孕烯醇酮(all

4、opregnanolone),又稱3α,5α-四氫孕酮(3α,5α-tetrahydroprogesterone,3α,5α-THP),是一種重要的神經(jīng)活性甾體。有文獻報道,上調脊髓3α,5α-THP可產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛作用,脊髓3α,5α-THP可能是NPP的重要調控分子。相關研究資料提示,鉤吻素子抗NPP作用與脊髓3α,5α-THP可能有關,但其關聯(lián)規(guī)律有待于探索。鑒此,本文擬在大鼠CCI模型上,采用多學科技術手段,探討鉤吻素子抗NPP

5、作用與其調控脊髓別孕烯醇酮水平的關系,探求其作用的關鍵效應分子;進而深入探索鉤吻素子抗NPP作用與其調節(jié)脊髓別孕烯醇酮合成關鍵酶3α-羥化類固醇脫氫酶的關聯(lián)規(guī)律,明確其作用的靶標,以期闡釋鉤吻素子抗NPP作用的脊髓分子機制,為防治NPP新藥研發(fā)提供新的藥物作用靶點與作用途徑,并有助于深化理解NPP的中樞機制;也為提出鉤吻素子抗NPP新功效奠定理論基礎。
　　具體研究內容如下:
　　1.鉤吻素子抗CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛的作用

6、。
　　在大鼠坐骨神經(jīng)慢性結扎損傷(Chronic constriction injury,CCI)所致的神經(jīng)病理性疼痛模型上,探討鉤吻素子對CCI大鼠熱輻射痛閾和機械刺激痛閾的影響。將基礎痛域閾合格的動物隨機分成假手術(Sham),CCI模型組,CCI+鉤吻素子(7mg·kg-1、1.4mg·kg-1和0.28mg·kg-1)三3個劑量組及CCI+加巴噴丁(40mg·kg-1)組。分別測定大鼠左右兩側足底對熱輻射和機械刺激的縮足

7、反應時間(TWL和MWL),術后測定時間為術后第3天,、第5天,、第7天,、第9天。術后第3天開始,假手術組和CCI模型組大鼠皮下注射生理鹽水,CCI大鼠給藥組大鼠皮下注射對應藥物,每天2次,連續(xù)7天。實驗結果表明,鉤吻素子具有顯著的抗CCI大鼠熱輻射痛敏與機械刺激痛覺超敏的作用,鎮(zhèn)痛效應呈劑量和時間依賴性;鉤吻素子(7mg·kg-1)給藥2天即可顯示鎮(zhèn)痛作用,并且在給藥后第7天達到最大鎮(zhèn)痛作用(％抑制率:熱輻射痛抑制率86.2±2.0

8、%和機械刺激痛抑制率81.7±2.3%)。結果提示鉤吻素子具有較強的抗NPP作用。
　　2.鉤吻素子慢性給藥對CCI所致神經(jīng)痛大鼠脊髓腰段脊髓別孕烯醇酮水平的影響。
　　在大鼠CCI術后神經(jīng)病理性疼痛模型基礎上,鉤吻素子治療連續(xù)給藥7天后,觀察大鼠脊髓腰段(L5-6)別孕烯酮醇(3α,5α-THP)變化。實驗動物分為假手術組(Sham)、CCI模型組和CCI+鉤吻素子(7mg·kg-1、1.4mg·kg-1和0.28mg·k

9、g-1)三3個劑量組。結果顯示鉤吻素子發(fā)揮顯著的抗神經(jīng)病理性疼痛效應同時,可顯著提高CCI模型大鼠腰段脊髓別孕烯醇酮的水平,作用呈劑量依賴性,表明鉤吻素子抗NPP神經(jīng)病理性疼痛作用與其提高腰段脊髓內神經(jīng)活性甾體別孕烯醇酮的水平有關,提示后者可能是鉤吻素子抗NPP作用相關的關鍵效應分子。
　　上述研究表明,鉤吻素子能治療CCI所致的外周神經(jīng)病理性疼痛,并且能夠劑量依賴地提高CCI大鼠腰段脊髓別孕烯醇酮的水平。別孕烯醇酮合成關鍵酶3α

10、-羥化類固醇脫氫酶(3α-HSD)催化5α-二氫孕酮直接生成3α,5α-四氫孕酮。為了明確鉤吻素子提高CCI大鼠腰段脊髓別孕烯醇酮的機制,下述從脊髓3α-HSD結構(酶表達)與功能(酶活性)角度,深入探討鉤吻素子抗NPP作用與其調節(jié)脊髓背角3α-HSD的可能關聯(lián)規(guī)律。
　　3.鉤吻素子對CCI大鼠術后神經(jīng)病理性疼痛過程中脊髓背角3α-HSD酶表達的影響。
　　通過熒光免疫組化技術動態(tài)觀察CCI大鼠鉤吻素子治療后3α-HSD酶

11、脊髓表達的變化。實驗動物隨機分為空白對照組(Nave)、假手術組(Sham)、CCI模型組、CCI+鉤吻素子高劑量(7mg·kg-1)組、CCI+鉤吻素子低劑量(0.28mg·kg-1)組。各組動物(除Naive組)于術后第3天開始給藥,給藥體積給藥體積為0.25mL/100g,Sham組、CCI組每天2次皮下注射生理鹽水;CCI+鉤吻素子高劑量(7mg·kg-1)組、CCI+鉤吻素子低劑量(0.28mg·kg-1)組每天2次皮下注射鉤

12、吻素子。各組分別于術后第4天、第6天、第9天上午給藥后1h以及術后第13天大鼠斷頭處死,取腰5-6段脊髓進行3α-HSD酶熒光免疫組化。結果顯示,CCI組大鼠術側脊髓背角3α-HSD酶熒光染色強度在術后有逐天上升的趨勢,術后第6、9和13天其3α-HSD酶熒光免疫染色顯著增強;CCI術后第9天(給藥第7天),鉤吻素子可顯著增強CCI大鼠脊髓背角3α-HSD酶熒光免疫染色強度,作用隨劑量增大而增強。3α-HSD酶在脊髓背角分布廣泛,可在神

13、經(jīng)元、小膠質細胞和星形膠質細胞表達分布。
　　4.鉤吻素子對CCI大鼠術后神經(jīng)病理性疼痛過程中脊髓背角3α-HSD酶基因表達的影響。
　　采取Realtime-PCR方法動態(tài)研究CCI大鼠術后鉤吻素子治療后腰段脊髓3α-HSDmRNA表達水平隨術后時間的變化情況。同上分組,實施藥物干預、取材;提取脊髓RNA,測定RNA的完整性和濃度;采用Realtime-PCR研究鉤吻素子對CCI大鼠腰段脊髓別孕烯醇酮合成酶3α-HSDmR

14、NA水平的影響。結果表明,CCI組大鼠脊髓內3α-HSDmRNA水平在術后有逐天上升的趨勢,術后第6、9和13天其水平顯著上升;術后第9、13天,鉤吻素子可顯著提高CCI大鼠脊髓內3α-HSDmRNA水平,作用隨劑量增大而增強。上述結果提示,鉤吻素子可能通過增強CCI大鼠腰段脊髓3α-HSDmRNA表達從而提高3α-HSD酶蛋白的水平。
　　5.鉤吻素子對CCI大鼠術后神經(jīng)病理性疼痛過程中脊髓3α-HSD酶活性的影響。
　　

15、利用3α-HSD酶動力學法,觀察鉤吻素子對CCI大鼠術后神經(jīng)病理性疼痛過程中脊髓3α-HSD酶活性的影響。實驗分為空白對照組(na?ve)、假手術組(sham)、CCI模型組、CCI+鉤吻素子7mg·kg-1和0.28mg·kg-1劑量組。術后第3天開始,假手術組和CCI模型組大鼠皮下注射生理鹽水,給藥組大鼠皮下注射對應劑量的鉤吻素子,每天2次,連續(xù)7天。于第7天給藥后1h,大鼠斷頭迅速取出腰5-6段脊髓,在組織酶液提取后進行酶活性分析

16、。結果表明,CCI模型大鼠3α-HSD酶活性顯著提高,鉤吻素子可顯著提高CCI大鼠脊髓內3α-HSD酶活性,作用隨劑量增大而增強。
　　6.醋酸甲羥孕酮(MPA)對鉤吻素子抗CCI大鼠術后機械痛敏作用的影響。
　　在CCI大鼠模型上,觀察脊髓蛛網(wǎng)膜下腔注射3α,5α-四氫孕酮合成關鍵酶3α-羥化類固醇脫氫酶的抑制劑醋酸甲羥孕酮(MPA)對鉤吻素子抗神經(jīng)病理性疼痛作用的影響。大鼠行蛛網(wǎng)膜下腔置管術,術后2-3天蛛網(wǎng)膜下腔注射利

17、多卡因鑒定置管術是否成功。置管術成功的大鼠恢復適應后,進行CCI手術。以機械刺激痛閾為指標篩選CCI痛敏大鼠。將CCI痛敏大鼠隨機分為DMSO+NS組、MPA(1.25mg·kg-1)+NS組、DMSO+KM組、MPA(0.25mg·kg-1)+KM組、MPA(0.5mg·kg-1)+KM組和MPA(1.25mg·kg-1)+KM組。CCI術后第9天,不同組分別蛛網(wǎng)膜下腔注射溶媒DMSO或不同劑量MPA,0.5h后皮下注射鉤吻素子(7m

18、g·kg-1)或生理鹽水,再過1小時測量大鼠機械刺激縮足潛伏期。結果顯示,外周皮下注射給予鉤吻素子可顯著對抗CCI大鼠機械刺激痛覺超敏,而脊髓蛛網(wǎng)膜下腔注射給予MPA可劑量依賴性翻轉外周皮下注射給予鉤吻素子的抗CCI大鼠機械刺激痛覺超敏的作用,但脊髓蛛網(wǎng)膜下腔注射MPA本身對CCI大鼠機械刺激痛覺超敏作用沒有顯著影響,提示鉤吻素子抗神經(jīng)病理性疼痛作用可能與其上調脊髓3α-羥化類固醇脫氫酶酶活性有關。
　　綜上,鉤吻素子可能通過增強