小鼠胚胎E10～E12造血擴增部位的探尋及其分子作用機制的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：探討AGM時期（E10～E12）小鼠造血部位的解剖結(jié)構(gòu)
　　 目的：探討AGM時期（E10～E12）小鼠造血部位的解剖結(jié)構(gòu)。
　　 方法：將雌、雄小鼠以3：1合籠喂養(yǎng)，觀察小鼠陰道栓獲得準確孕期的小鼠胚胎，收集E10，E10.5，E11，E11.5和E12小鼠胚胎，去掉胎膜和胎盤，用4%甲醛固定3h后，進行乙醇脫水，石蠟包埋，通過胚胎正中矢狀面組織切片，進行HE染色，在顯微鏡

2、下連續(xù)觀察造血部位的組織結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：胚胎正中矢狀面切片，自E10到E12，在腹部背側(cè)并沒有見到典型的性腺，即中腎和主動脈構(gòu)成的空腔管狀結(jié)構(gòu)，卻發(fā)現(xiàn)在E10時心臟已經(jīng)發(fā)育，表現(xiàn)為圓球形，內(nèi)部由心肌細胞及表面的內(nèi)皮細胞構(gòu)成網(wǎng)狀的空間結(jié)構(gòu)，可以看到E10小鼠胚胎已經(jīng)建立循環(huán)，血管管腔和心臟內(nèi)部可見少量胞體較大、胞漿豐富的造血干細胞。E11的心臟組織切片形態(tài)較E10.5并無明顯變化，但此時期心腔內(nèi)的造血細胞數(shù)量明顯增多，容易見到

3、造血細胞與心臟內(nèi)皮細胞接觸。隨著胚胎的發(fā)育，心臟的形態(tài)很快變化，內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸減少，在E12已具備成體心臟的特點，成為空腔性結(jié)構(gòu)。小鼠E10胚胎中胎肝已經(jīng)發(fā)育，起初為實質(zhì)的結(jié)構(gòu)，由胎肝細胞緊密聯(lián)系而構(gòu)成，內(nèi)部管腔少，隨著胚胎的發(fā)育，胎肝內(nèi)部血管增多。
　　 結(jié)論：通過E10～E12胚胎正中矢狀面連續(xù)切片和HE染色，并未發(fā)現(xiàn)典型的AGM區(qū)結(jié)構(gòu)，可能與組織切片的局限性有關(guān)；心臟起初內(nèi)部呈復(fù)雜的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且心肌細胞表面覆蓋有一層

4、內(nèi)皮細胞，在造血干細胞發(fā)育過程中構(gòu)成了巨大的表面積。
　　 第二部分：探討E10～E12期間小鼠胚胎造血發(fā)育的分子機制
　　 目的：研究E10～E12期間小鼠胚胎心臟內(nèi)皮細胞特性及與造血的發(fā)育相關(guān)的分子機制。
　　 方法：將E10～E12小鼠胚胎的組織切片做免疫組化，檢測胚胎心臟是否表達血管特異性標(biāo)志CD34蛋白；利用已制備好的石蠟切片，通過免疫組化檢測各時間點胚胎心臟和胎肝中Notch信號通路相關(guān)分子，Notc

5、h1和Jagged1蛋白的表達水平；并且用免疫磁珠分選出c-kit陽性細胞，通過免疫熒光的方法檢測其細胞表面Notch1蛋白的表達情況。分別取出E10，E10.5，E11，E11.5和E12的胚胎心臟、胎肝和AGM區(qū)組織，經(jīng)機械碾磨、膠原酶消化和過濾制備單個細胞懸液，采用差異貼壁法及貼壁培養(yǎng)獲得基質(zhì)細胞，觀察各組織貼壁細胞形態(tài)，檢測CD31表達情況。
　　 結(jié)果：E10～E12的小鼠胚胎心臟的心肌細胞及其表面的內(nèi)皮細胞均表達血管

6、特異性標(biāo)志CD34蛋白，以E11表達強度最高，同時可以見到循環(huán)的造血細胞也大多表達CD34抗原。對組織切片進行了Notch信號通路免疫組化的研究，發(fā)現(xiàn)E10心臟心肌細胞及其表面的內(nèi)皮細胞形成的中空的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)都表達Jagged1蛋白和Notch1蛋白，前者表達水平高于后者，以E10.5時水平最高，且隨著心臟的發(fā)育和形態(tài)改變，表達水平逐漸下降，到E12時幾乎消失。同時發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞也表達Jagged1，但是不表達Notch1蛋白。用c-k

7、it單抗的免疫磁珠分選出c-kit陽性細胞，通過免疫熒光，顯示這群細胞表面均勻的表達Notch1蛋白。原代心臟貼壁細胞由體積較大、胞漿豐富、呈不規(guī)則形的心肌細胞和細長梭形、胞漿較少的內(nèi)皮細胞構(gòu)成，容易看到心臟內(nèi)皮細胞貼附在心肌細胞表面，呈均一的細長梭形排列，表達CD31抗原。胎肝貼壁細胞形態(tài)相對均一，均為胞體較大、胞漿豐富的細胞。同期AGM區(qū)貼壁細胞在原代細胞中也可見兩個細胞群體，包括胞體較大的貼壁細胞和細長梭形的內(nèi)皮細胞，形態(tài)與心臟貼

8、壁細胞相似。
　　 結(jié)論：胚胎E10～E12期間心臟的心肌細胞及其內(nèi)皮細胞均表達CD34抗原，具備血管內(nèi)皮細胞特性，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成巨大的表面積，并且高表達Jagged1和Notch1蛋白，形成胚胎造血良好的微環(huán)境，可能參與此時期造血干細胞的發(fā)育和擴增。
　　 第三部分：E10～E12時期造血相關(guān)部位 Notch信號通路的變化水平及對胚胎中期 HSCs擴增部位的初探
　　 目的：E10～E12時期造血的相關(guān)部位Not

9、ch信號通路的變化水平及對胚胎中期HSCs擴增部位的初探。
　　 方法：通過實時定量PCR連續(xù)觀察E10，E10.5，E11，E11.5和E12心臟內(nèi)皮細胞和胎肝基質(zhì)細胞Notch1及Jagged1表達及變化水平。用流式單標(biāo)檢測各時間點心臟和胎肝中c-kit+細胞比率。將培養(yǎng)24h后的E11心臟懸浮細胞分別置入由同期的心臟內(nèi)皮細胞、胎肝基質(zhì)細胞和AGM區(qū)基質(zhì)細胞構(gòu)成的共培養(yǎng)體系中，于0h，24h和48h分別檢測c-kit+細胞比

10、率，研究各組織基質(zhì)細胞對HSCs擴增的影響。
　　 結(jié)果：盡管傳代對心臟貼壁細胞形態(tài)有影響，但是傳代和原代細胞中Jagged1和Notch1基因的表達水平?jīng)]有變化。我們發(fā)現(xiàn)：心臟貼壁細胞的Jagged1基因在E10.5到最高，跟E10的基因水平相比較，為E10的（5.46±2.2）倍，E11時的表達下降，幾乎與E10相同，但是E11.5和E12時心臟內(nèi)皮細胞Jagged1表達均很低，分別為E10的（0.15±0.44）倍和（0.

11、12±0.50）倍。但是胎肝基質(zhì)細胞Jagged1基因除E11的表達與E10的心臟內(nèi)皮細胞相近外，其余胚胎時期均呈低水平表達。通過流式檢測c-kit+細胞我們發(fā)現(xiàn)，胚胎期心臟和胎肝c-kit+細胞比率幾乎一致，E11時c-kit+細胞明顯增多，分別高達（12.6±3.2）%和（9.6±2.8）%，但E12時心臟中c-kit+細胞明顯減少，僅為（3.4±1.2）%，此時胎肝中c-kit+細胞為（11.6±4.1）%。E11的懸浮細胞與心臟

12、內(nèi)皮細胞和AGM區(qū)基質(zhì)共培養(yǎng)24h時，c-kit+細胞數(shù)量保持穩(wěn)定，但在胎肝基質(zhì)細胞中c-kit+細胞數(shù)量明顯減少，在共培養(yǎng)48h，三組中的c-kit+細胞均呈較低水平，組間沒有顯著性差異。
　　 結(jié)論：心臟內(nèi)皮細胞中Jagged1基因表達是變化的，在E10.5時表達最高，伴隨著c-kit+細胞數(shù)量的擴增。Notch信號通路在胎肝中HSCs的發(fā)育并不起主要作用。通過c-kit+細胞分別與各種同時期基質(zhì)細胞共培養(yǎng)，推測E11胚胎心