輻射-熱激雙啟動子介導(dǎo)的抗腫瘤基因-磁性復(fù)合納米系統(tǒng)的構(gòu)建及治療肝癌的實驗研究.pdf

1、第一部分熱療用磁性納米基因載體PEI-Mn0.5Zn0.5Fe2O4的制備及表征
　　 目的:①研究腫瘤熱療用Mn0.5Zn0.5Fe2O4(MZF)磁性納米粒子的制備及表征。②研究PEI對磁性Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒的表面修飾及特性檢測，生物相容性評價及其作為基因載體的可行性研究。
　　 方法:①采用改良的化學(xué)共沉淀法制備Mn0.5Zn0.5Fe2O4(MZF)磁性納米粒子。運用高分辨電鏡(High R

2、esolution Electron Microscopy, HREM)， X射線衍射分析(x-raydiffraction，XRD)，能譜儀(energy dispersive spectrometer, EDS)對納米粒的形貌，結(jié)構(gòu)及成分進(jìn)行分析，并在高頻交變磁場(AMF)下檢測MZF磁流體的體外升溫情況。②MTT實驗評價修飾前后的納米材料的細(xì)胞毒性;溶血試驗評價其有無溶血作用;小鼠腹腔注射材料混懸液以測定其LD50;微核試驗評價其

3、有無致畸、致突變作用。③采用聚乙烯亞胺(PEI)對MZF進(jìn)行表面修飾，傅立葉紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)檢測表面的官能團(tuán)變化，并在高頻交變磁場(AMF)下檢測PEI-MZF磁流體的升溫效果。④瓊脂糖凝膠電泳檢測PEI-MZF與DNA的結(jié)合情況。
　　 結(jié)果:①Mn0.5Zn0.5Fe2O4磁性納米粒的表征:HREM圖顯示MZF磁性納米粒大小較均勻、電子密度高

4、，粒徑在30nm-40nm之間;EDS證實制備的MZF納米粒中含有Mn，Zn，F(xiàn)e與O四種元素，且Mn，Zn，F(xiàn)e的摩爾比約為1∶1∶4;XRD表明制備的MZF各個衍射峰所對應(yīng)的面間距（d值）與粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合會(JCPDS)編制的代表物質(zhì)為尖晶石型磁性的PDF（Powder Diffraction File）卡片d值吻合一致。體外升溫試驗，AMF作用下不同濃度的MZF納米磁流體均能升溫到39℃～50℃，且加熱40min后溫度基本保持恒

5、定。②MZF磁性納米粒的浸提液對L-929細(xì)胞細(xì)胞相容的毒性0～1級，無毒性;無溶血發(fā)生;LD50為3.392g/kg，95％的可信區(qū)間為1.245～9.243g/kg，具有較廣的安全值范圍;微核試驗證實該材料無致畸或致突變作用。③修飾后的PEI-MZF的表征:FTIR顯示修飾后粒子的紅外光譜圖出現(xiàn)了—NH2和—CH2—的特征小峰，證明了PEI在顆粒表面能夠產(chǎn)生吸附。體外升溫實驗顯示，10mg/mL的MZF磁性納米粒和PEI-MZF復(fù)合

6、納米粒的磁流體在相同強度的AMF作用下，升溫能力相同，可用于熱療。④瓊脂糖凝膠電泳示PEI-MZF與DNA二者質(zhì)量比為20時結(jié)合情況良好。
　　 結(jié)論:①應(yīng)用化學(xué)共沉淀法己成功制備了Mn0.5Zn0.5Fe2O4磁性納米粒且PEI成功地包覆于MZF的表面。②修飾前后的復(fù)合納米粒均具有良好的磁響應(yīng)性，吸收磁能而升溫的能力，及作為基因載體的可行性，可以進(jìn)一步用于腫瘤的聯(lián)合治療。
　　 第二部分輻射/熱激雙啟動子介導(dǎo)的抗腫瘤基

7、因(pEgr1-Hsp70-HSV-TK)真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及其在細(xì)胞內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)
　　 目的:構(gòu)建用于基因治療的輻射/熱激雙啟動子抗腫瘤基因(Egr1-pHsp70-HSV-TK)重組真核表達(dá)質(zhì)粒，并體外轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，觀察在輻射、熱激或二者共同誘導(dǎo)后HSV-TK基因的表達(dá)情況。
　　 方法:①以真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-CMVE-Egr1p為模板，PCR擴(kuò)增得到CMVE-Egr1片段，然后將其亞克隆至pCD

8、NA3.1-EGFP質(zhì)粒上，構(gòu)建輻射誘導(dǎo)的pCDNA3.1-Egr1-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒。②以pD3SX-Hsp70-HSVTK質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到HSV-TK片段，將其構(gòu)建至pCDNA3.1-Egr1-EGFP中，取代EGFP，得到pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSVTK質(zhì)粒。③同樣以pD3SX-Hsp70-HSVTK質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到Hsp70片段，將其構(gòu)建至1步所得的質(zhì)粒中，得到pCDNA3.1-Egr1

9、-Hsp70-EGFP雙啟動子質(zhì)粒。④將Hsp70片段亞克隆至pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK上，構(gòu)建輻射、熱激雙啟動子pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSVTK質(zhì)粒。⑤每個構(gòu)建步驟后均需挑取陽性克隆，測序鑒定后進(jìn)行下一步的構(gòu)建。最后大量抽提質(zhì)粒。⑥磁性轉(zhuǎn)染法將pCDNA3.1-Egr1-HSVTK基因?qū)際EK293細(xì)胞，2GyX線照射1h、6h、12h、24h和48h后， Real-time PCR法檢測TK基因表達(dá)

10、量的差異。HEK293細(xì)胞經(jīng)1Gy，2Gy，4Gy，8Gy，16Gy不同劑量X射線照射，6h后收集各組細(xì)胞，與未處理組比較，觀察射線照射對TK基因表達(dá)量的影響。同樣轉(zhuǎn)染方法將雙啟動子質(zhì)粒導(dǎo)入HEK293細(xì)胞，比較經(jīng)2Gy X線照射聯(lián)合磁熱療，單純輻射，單純磁熱療處理6h后，各組與不誘導(dǎo)組的TK基因表達(dá)量的差異。⑦磁性轉(zhuǎn)染法將雙啟動子的HSV-TK質(zhì)粒導(dǎo)入HEK293，輻射、加熱誘導(dǎo)后，Real-time-PCR法檢測TK基因的整合。

11、r>　　 結(jié)果:①酶切、測序鑒定結(jié)果表明每步均得到了目的質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的目的基因分子量與預(yù)計的相同，插入載體位置正確，測序發(fā)現(xiàn)插入片段序列無改變，且開放讀碼框正確。②pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSVTK基因轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，2Gy X線照射1h、6h、12h、24h和48h后，TK基因表達(dá)量由相對熒光強度表示，發(fā)現(xiàn)熒光強度先增強后減弱，6h時熒光強度最強。各組熒光強度分別為1.86±0.21(1h)，4.5

12、3±0.29(6h)，3.72±0.30(12h)，1.31±0.19(24h)和0.33±0.15(48h)，經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)6h，12h與1h，24h及48h組相比P＜0.05。HEK293細(xì)胞經(jīng)0Gy，1Gy，2Gy，4Gy，8Gy，16Gy不同劑量X射線照射后，熒光強度分別為0.47±0.04，0.56±0.02，2.78±0.12，1.95±0.05，1.81±0.09和1.67±0.18，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)照射組與未照射組相

13、比P＜0.05，尤以2Gy的差異最顯著。HEK293細(xì)胞經(jīng)不同誘導(dǎo)條件處理后，相對熒光強度分別為0.49±0.03（未誘導(dǎo)組），0.71±0.04（單純輻射誘導(dǎo)組），0.84±0.04（單純熱誘導(dǎo)組）和1.19±0.03（輻射聯(lián)合熱誘導(dǎo)組），方差分析發(fā)現(xiàn)熱聯(lián)合輻射誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)及單純誘導(dǎo)組相比P＜0.05。③轉(zhuǎn)染pEgr1-Hsp70-HSV-TK的SMMC-7721細(xì)胞擴(kuò)增出正確的TK基因條帶。
　　 結(jié)論:抗腫瘤基因（pCD

14、NA3.1-Egr1-Hsp70-HSVTK）質(zhì)粒構(gòu)建成功并且可以被熱、輻射雙重誘導(dǎo)，為利用其進(jìn)行靶向性基因治療打下了基礎(chǔ)。
　　 第三部分輻射/熱激雙啟動子介導(dǎo)的抗腫瘤基因/磁性復(fù)合納米系統(tǒng)(pEgr1-Hsp70-HSVTK/GCV/PEI-MZF)對肝癌的治療研究
　　 目的:以PEI-Mn0.5Zn0.5Fe2O4復(fù)合納米粒作為抗腫瘤基因pEgr-1-Hsp70-HSV-TK的運載體，構(gòu)建pEgr-1-Hsp70

15、-HSV-TK/GCV/PEI-MZF磁性復(fù)合納米系統(tǒng)（下同），在磁熱療和輻射的雙重誘導(dǎo)和聯(lián)合治療作用下，研究其對人肝癌細(xì)胞和移植瘤的治療作用。
　　 方法:①以修飾的復(fù)合材料PEI-MZF作為pEgr1-Hsp70-HSVTK質(zhì)粒的載體，轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞SMC7721中，并置于直線加速器下照射和交變磁場中感應(yīng)升溫，誘導(dǎo)HSV-TK基因的表達(dá)。②MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)法，流式細(xì)胞儀(FC

16、M)評價輻射、熱雙敏基因pEgr1-Hsp70-HSVTK聯(lián)合熱、放療對肝癌細(xì)胞生長的影響，并采用透射電鏡(TEM)和Caspase檢測試劑盒初步抗肝癌機(jī)制。③將PEI-MZF與pEgr1-Hsp70-HSVTK的復(fù)合物注射到裸鼠人肝癌移植瘤中，經(jīng)外照射和熱療作用3次，21d后處死裸鼠，制作腫瘤組織標(biāo)本，進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查。
　　 結(jié)果:
　　 ①MTT結(jié)果表明PEI-MZF/pEgr1-Hsp70-HSVTK能顯著抑制

17、人肝癌SMMC7721細(xì)胞的增殖，F(xiàn)CM檢測顯示其能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡及周期阻滯，且其效果較單純放療組及單純磁流體熱療組明顯。電鏡照片可見聯(lián)合治療組細(xì)胞凋亡的形態(tài)及磁性材料在細(xì)胞內(nèi)的沉積。Caspase檢測結(jié)果顯示PEI-MZF/pEgr1-Hsp70-HSVTK介導(dǎo)的聯(lián)合治療可以激活Caspase家族3和8。②體內(nèi)抑瘤實驗:在PEI-MZF/pEgr1-Hsp70-HSVTK聯(lián)合外照射和熱療的作用下，聯(lián)合治療組的質(zhì)量抑瘤率與體積抑瘤率分別

18、為IM=80.10％和IV=83.77％，顯著高于單純基因治療組、單純磁熱療組、單純放療組和PEI-MZF/pHsp70-HSVTK聯(lián)合熱療組(P＜0.05)，各實驗組與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。病理學(xué)腫瘤組織切片發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組腫瘤組織壞死較其余組明顯。
　　 結(jié)論:①細(xì)胞實驗顯示:PEI-MZF-HSV-TK復(fù)合納米粒的三重治療能顯著抑制培養(yǎng)人肝癌SMC7721細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并使細(xì)胞周期被阻滯在S期。

19、②體內(nèi)實驗顯示:PEI-MZF-HSV-TK介導(dǎo)的熱、放療能增加腫瘤的質(zhì)量及體積抑制率，導(dǎo)致腫瘤組織壞死，抑制腫瘤增殖，從而具有治療移植性肝癌的作用。
　　 第四部分131I內(nèi)照射/熱激雙啟動子介導(dǎo)的抗腫瘤基因/磁性復(fù)合納米系統(tǒng)對肝癌移植瘤的治療研究
　　 目的:以PEI-MZF復(fù)合納米粒作為pEgr-1-Hsp70-HSV-TK基因的運載體，構(gòu)建pEgr-1-Hsp70-HSV-TK/GCV/PEI-MZF磁性復(fù)合納米

20、系統(tǒng)（下同），在磁熱療和131I內(nèi)照射的雙重誘導(dǎo)和聯(lián)合治療作用下，研究其對人肝癌細(xì)胞和移植瘤的體內(nèi)治療作用。
　　 方法：①以培養(yǎng)的Bel-7402肝癌細(xì)胞皮下注射于裸鼠右前肢皮下，以獲得人肝癌的移植瘤模型。②將PEI-MZF/pEgr1-Hsp70-HSVTK的復(fù)合物注射到裸鼠人肝癌移植瘤中，經(jīng)131I內(nèi)照射和/或熱療作用3次，治療后每5d測量一次腫瘤直徑，繪制腫瘤的生長曲線。21d后處死裸鼠，制作腫瘤組織標(biāo)本，進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)

21、檢查。核素相關(guān)治療組行核醫(yī)學(xué)檢查，于第1、2、7、14天行SPECT顯像。
　　 結(jié)果：①大約2-3周后，裸鼠右前肢皮下長出約80-120mm3的腫瘤。②SPECT顯像:在給予放射性核素的1、2、7天均可觀察到放射性核素在腫瘤部位的分布，但14天時信號微弱，基本不可探測。③治療后各組腫瘤的生長趨勢:在治療后5天，治療組與未治療組腫瘤的增長速度開始出現(xiàn)差異，到第10天時差異己非常明顯。核素、熱、基因三聯(lián)治療組的生長速率始終低于其他

22、各組。④體內(nèi)抑瘤實驗:PEI-MZF/pEgr1-Hsp70-HSVTK聯(lián)合核素和熱療組的質(zhì)量抑制率和體積抑制率分別為IM=83.54％和IV=81.09％，顯著高于單純磁熱療組、單純放療組和輻射基因治療組(P＜0.05)，各實驗組與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。病理學(xué)腫瘤組織切片發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組腫瘤組織壞死較其余組明顯。
　　 結(jié)論：移植瘤治療實驗顯示:熱療、核素內(nèi)照射介導(dǎo)的PEI-MZF-HSV-TK能增加腫瘤的質(zhì)