芹菜素通過抑制Nrf2-ARE通路逆轉肝癌耐藥的研究.pdf

1、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,簡稱肝癌)是常見惡性腫瘤之一。化療是肝癌治療的重要手段。然而,化療耐藥的存在,特別是多藥耐藥現(xiàn)象(multidrug resistance,MDR)是導致肝癌化療失敗的主要原因。
　　核轉錄因子紅細胞系相關因子-2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)是細胞內(nèi)重要的抗氧化應激調(diào)控因子,調(diào)控一系列細胞保護

2、基因的表達。目前,Nrf2已成為逆轉腫瘤耐藥的重要靶點之一。因此,開發(fā)以Nrf2為靶點的小分子抑制劑與抗腫瘤藥聯(lián)用,增強腫瘤細胞對化療藥的敏感性,從而改善化療藥的治療效果,為腫瘤協(xié)同治療提供新途徑。
　　已發(fā)現(xiàn)一些黃酮類化合物是有效的Nrf2抑制劑,如表沒食子兒茶素3-沒食子酸酯(epigallocatechin 3-gallate,EGCG)、鴉膽子苦醇和木犀草素等。那么,芹菜素(4',5,7-trihydroxyflavone

3、,apigenin,APG)作為一種與EGCG、鴉膽子苦醇和木犀草素等Nrf2抑制劑結構類似且同樣具有抗癌潛力的天然黃酮類物質(zhì),是否也能有效抑制Nrf2通路,進而增敏腫瘤細胞逆轉耐藥呢?目前尚未見相關報道。為此,本研究將研究APG對肝癌耐藥細胞的逆轉作用,并從Nrf2通路探討其逆轉耐藥的作用機制。
　　第一部分：Nrf2與肝癌阿霉素耐藥相關性的研究
　　目的:探討肝癌中Nrf2的表達與阿霉素(doxorubicin,ADM)

4、化療耐藥的關系。
　　方法:免疫組化法檢測Nrf2、醛酮還原酶1B10(aldo-keto reductase 1B10,AKR1B10)、多藥耐藥相關蛋白5(multidrug resistance-associated protein 5,MRP5)在肝癌組織中的表達,分析Nrf2表達與AKR1B10、MRP5表達及與肝癌臨床病理學特征之間的關系,免疫蛋白印跡法檢測比較Nrf2在人肝癌親本細胞株BEL-7402細胞和ADM選擇

5、性誘導的多藥耐藥細胞株BEL-7402/ADM細胞中的表達差異,通過siRNA干擾Nrf2表達后,MTT法檢測細胞對ADM敏感性的變化。
　　結果:Nrf2、AKR1B10和MRP5在肝癌組織中表達水平明顯高于癌周正常組織(P<0.01;P<0.01;P<0.01),肝癌組織中AKR1B10和MRP5表達水平均與Nrf2表達水平呈顯著正相關(P=0.009;P=0.016)。在肝癌中,Nrf2的表達與腫瘤分化程度(P=0.017)

6、、TNM分期(P=0.028)、肝硬化病史(P=0.017),早期復發(fā)(P=0.016)密切相關。Nrf2在肝癌耐藥細胞株BEL-7402/ADM較敏感細胞株BEL-7402中蛋白表達顯著增加,且干擾Nrf2基因表達后,肝癌耐藥細胞株BEL-7402/ADM對ADM的敏感性顯著增強。
　　結論:本研究表明肝癌中Nrf2的高表達可能與ADM耐藥相關。
　　第二部分：芹菜素通過抑制PI3K/Akt/Nrf2通路逆轉BEL-740

7、2/ADM耐藥
　　目的:Nrf2是細胞內(nèi)重要的抗氧化應激調(diào)控因子,調(diào)控一系列細胞保護基因的表達。目前,Nrf2已成為逆轉腫瘤耐藥的重要靶點之一。在本實驗中,我們將研究APG是否可以通過抑制Nrf2通路進而逆轉BEL-7402/ADM細胞耐藥。
　　方法:MTT實驗檢測APG對BEL-7402/ADM細胞耐藥性的逆轉情況。熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測APG對細胞內(nèi)ADM濃度的影響。實時定量PCR和免疫蛋白印跡法分析APG對Nr

8、f2通路的抑制作用。
　　結果:在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)無毒劑量的APG可明顯增強BEL-7402/ADM對抗癌藥的敏感性,增加細胞內(nèi)ADM蓄積。機制上,APG通過抑制PI3K/Akt信號通路,進而下調(diào)Nrf2mRNA和蛋白水平,并導致Nrf2下游基因HO-1、AKR1B10和MRP5表達減少,最終逆轉細胞耐藥。
　　結論:結果表明APG可通過下調(diào)PI3K/Akt/Nrf2信號通路,進而增強人肝癌耐藥細胞BEL-7402/ADM

9、對ADM的敏感性,逆轉腫瘤耐藥。
　　第三部分：芹菜素聯(lián)合阿霉素對人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用
　　目的:探討APG聯(lián)合ADM對人肝癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其相關機制。
　　方法:建立BEL-7402裸鼠皮下移植瘤動物模型,32只BEL-7402細胞株移植成功的裸鼠隨機分為四組:對照組、APG組(50mg/kg)、ADM組(3mg/kg)和聯(lián)合用藥組(APG50mg/kg+ADM3mg/kg),每組8只。上述藥物

10、每3d腹腔注射l次,共7次,觀察各組藥物對腫瘤的抑制作用。給藥結束后處死裸鼠,切取移植瘤組織。免疫組化法檢測Ki-67蛋白表達評價腫瘤細胞增殖。TUNEL染色評價腫瘤細胞凋亡情況。免疫蛋白印跡法檢測腫瘤組織Nrf2蛋白的表達。
　　結果:與單藥組相比,聯(lián)合應用APG及ADM顯著抑制腫瘤生長,誘導腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤細胞增殖。此外,聯(lián)合用藥還能下調(diào)腫瘤組織Nrf2蛋白的表達。
　　結論:本研究表明與APG或ADM單藥組相比,