土槿皮乙酸抑制胃癌體內(nèi)生長(zhǎng)及通過(guò)Cox-2-PKC-α-P-gp通路逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥.pdf

1、目的
　　化學(xué)治療是胃癌治療的重要手段，但多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)導(dǎo)致的治療效果降低成為胃癌治療的主要難點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)多藥耐藥的主要機(jī)制與P-gp表達(dá)過(guò)多有關(guān)。在腫瘤的多藥耐藥細(xì)胞中，環(huán)氧合酶-2(Cox-2)和蛋白激酶C(PKC)的亞型PKC-α的表達(dá)也有所增加。
　　土槿皮乙酸(PseudolaricacidB，PAB)是松科植物金錢(qián)松的近根樹(shù)皮或根皮中提取出來(lái)的一種二萜類酸，具有誘

2、導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡的活性，而且能逆轉(zhuǎn)肝癌QGY-TR50細(xì)胞株的多藥耐藥。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，PAB對(duì)人胃腺癌SGC7901細(xì)胞系及SGC7901/ADR細(xì)胞系具有明顯的體外抑制作用。但目前對(duì)于PAB的體內(nèi)抗腫瘤療效研究較少，而且其抑制腫瘤多藥耐藥的機(jī)制尚不清楚。本研究將探討PAB對(duì)胃癌裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用及其逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥的分子機(jī)制。
　　方法
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　常規(guī)培養(yǎng)人胃

3、癌SGC7901細(xì)胞及人胃癌多藥耐藥SGC7901/ADR細(xì)胞，SGC7901/ADR細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入1μg/ml阿霉素(ADR)維持其耐藥性。
　　2、人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立
　　將50只裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組25只，分別于裸鼠腋下接種兩種細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，建立胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，每組再隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、吐溫對(duì)照組、阿霉素組、土墐皮乙酸組及阿霉素和土墐皮乙酸聯(lián)合給藥組5個(gè)亞組，每亞組5只裸鼠，每天一次分

4、別腹腔給予相應(yīng)的藥物注射治療，連續(xù)給藥20天。
　　3、人胃癌裸鼠皮下移植瘤體積和重量的測(cè)量與計(jì)算
　　每日測(cè)量裸鼠體重，隔日觀察移植瘤并用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑、短徑。分別計(jì)算各組中每只裸鼠的腫瘤體積、相對(duì)腫瘤體積、相對(duì)體重及藥物的平均抑瘤率。PAB和(或)ADR的治療效果通過(guò)移植瘤的大小和重量評(píng)價(jià)，以裸鼠體重變化評(píng)價(jià)藥物對(duì)裸鼠體重的影響。
　　4、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Cox-2、PKC-α及P-gp的表達(dá)
　　

5、分別取各組腫瘤組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋，4μm切片，以免疫組化SP法方法檢測(cè)Cox-2、PKC-α及P-gp的表達(dá)，顯微鏡下觀察染色的效果，顯微鏡下(×400)攝片。
　　5、Westernblot法檢測(cè)Cox-2、PKC-α及P-gp的表達(dá)
　　分別提取生理鹽水對(duì)照組、吐溫對(duì)照組、阿霉素組、土墐皮乙酸組及阿霉素和土墐皮乙酸聯(lián)合給藥組腫瘤組織的蛋白，以Westernblot法檢測(cè)Cox-2、PKC-α及P-gp的表達(dá)。<

6、br>　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS17.0分析軟件，采用ANOVE方差分析法中SNK和LSD法進(jìn)行差異性分析，P＜0.05提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1、土墐皮乙酸對(duì)胃癌裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用
　　裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于SGC7901細(xì)胞移植瘤，各治療組腫瘤體積均小于對(duì)照組(P＜0.05)，PAB組與ADR組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，聯(lián)合給藥組較各組抑瘤作

7、用增強(qiáng)(P＜0.05)，抑瘤率為88.1％;對(duì)于SGC7901/ADR細(xì)胞移植瘤，ADR組、PAB組、聯(lián)合給藥組抑瘤效果依次增強(qiáng)(P＜0.05)，抑瘤率分別為:21.9％、64.1％、85.8％。
　　2、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Cox-2、PKC-α及P-gp的表達(dá)
　　SGC7901/ADR細(xì)胞移植瘤對(duì)照組瘤組織中Cox-2、PKC-α、P-gp蛋白呈高表達(dá)，PAB組蛋白陽(yáng)性表達(dá)低于ADR組(P＜0.05)，聯(lián)合給藥組中三種蛋

8、白的陽(yáng)性表達(dá)低于其余各組(P＜0.05)。在NS對(duì)照組中，SGC7901細(xì)胞移植瘤的蛋白表達(dá)低于SGC7901/ADR細(xì)胞移植瘤(P＜0.05)。
　　3、Westernblot法分析Cox-2、PKC-α、P-gp的表達(dá)
　　對(duì)于鹽水對(duì)照組，胃癌敏感細(xì)胞移植瘤中三種蛋白的表達(dá)水平均低于耐藥細(xì)胞移植瘤(P＜0.05);SGC7901/ADR細(xì)胞移植瘤中，鹽水對(duì)照組與吐溫對(duì)照組間蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，Cox-2