和厚樸酚逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥及協(xié)同、增敏化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外藥效研究.pdf

1、腫瘤的多藥耐藥與化療的毒副反應(yīng)是臨床上制約惡性腫瘤患者化療的療效從而影響生存與預(yù)后的兩個(gè)嚴(yán)重問題. 多藥耐藥(Multidrug Resistance,MDR)是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時(shí),對其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性,是導(dǎo)致化療失敗的主要原因.臨床上對于腫瘤MDR及其預(yù)防與逆轉(zhuǎn)的研究主要集中在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵上,即我們通常所稱的耐藥蛋白.P-gp為其中最重要的一種耐藥蛋白,是引起大多數(shù)化療藥物MD

2、R的主要原因.研究腫瘤MDR及其預(yù)防與逆轉(zhuǎn)是腫瘤化療中函待解決的問題,亦是目前腫瘤研究的難點(diǎn)及熱點(diǎn)領(lǐng)域.此外,腫瘤化療中函待解決的另一件事就是化療藥物的毒副反應(yīng)問題.由于毒副反應(yīng)的出現(xiàn)直接導(dǎo)致患者對化療藥物"可耐受的最大劑量"不斷的降低,嚴(yán)重時(shí)甚至需中斷化療.因而藥物的毒副反應(yīng)已成為了制約化療藥物用藥劑量從而制約化療效果的重要因素.如何讓化療藥物增效減毒是目前腫瘤化療中函待解決的另一個(gè)問題. 由于中藥具有的獨(dú)特優(yōu)勢,從中藥中篩

3、選高效、低毒的單體化合物用于MDR逆轉(zhuǎn)及化療增效減毒已成為當(dāng)前腫瘤化療研究的熱點(diǎn).和厚樸酚是從傳統(tǒng)中藥厚樸中提取出來的一種主要活性成分,在前期的工作中,我們發(fā)現(xiàn)和厚樸酚可以誘導(dǎo)人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞發(fā)生非P53依賴性的凋亡;并能有效的抑制RKO細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長.前不久,我們研究小組還報(bào)道了高濃度的和厚樸酚可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生線粒體介導(dǎo)的可調(diào)控的非凋亡性死亡方式.此外,與本論文密切相關(guān)的是,我們通過前期的體外篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了和厚樸酚具有

4、逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的作用,進(jìn)一步的分子實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),其可以下調(diào)耐藥蛋白P-gp的上游調(diào)控靶點(diǎn)HIF-1α的表達(dá).而直至本研究開始前,尚無文獻(xiàn)報(bào)道和厚樸酚可以逆轉(zhuǎn)或預(yù)防P-gp相關(guān)的腫瘤多藥耐藥;此外,和厚樸酚與化療藥物聯(lián)用能否起協(xié)同作用或增敏作用也沒有人作出過探討.研究目的: 明確和厚樸酚對于腫瘤多藥耐藥細(xì)胞P-gp功能和表達(dá)的確切作用及其恢復(fù)耐藥細(xì)胞對于化療藥物敏感性的效果;研究和厚樸酚是否可以預(yù)防阿霉素誘導(dǎo)引起的腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生

5、;分析和厚樸酚與常見化療藥物聯(lián)用時(shí)產(chǎn)生的具體效應(yīng)及增敏化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的確切效果;通過建立荷耐藥移植瘤裸鼠模型來明確和厚樸酚聯(lián)合阿霉素治療耐藥腫瘤細(xì)胞移植瘤的體內(nèi)藥效.研究內(nèi)容:本論文主要研究內(nèi)容如下: 1.和厚樸酚逆轉(zhuǎn)及預(yù)防P-gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥的藥效及機(jī)理研究 1.1和厚樸酚對耐藥細(xì)胞P-gp功能的影響Rh-123是特異性的P-gp底物,是指示P-gp功能的常用熒光物質(zhì).我們用和厚樸酚對細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間的預(yù)處

6、理,然后用Rh-123積聚實(shí)驗(yàn)來反映P-gp功能的變化.結(jié)果顯示,在和厚樸酚短時(shí)間(24小時(shí)以內(nèi))的預(yù)處理下,Rh-123積聚水平無明顯提高;當(dāng)預(yù)處理時(shí)間達(dá)到48小時(shí)才出現(xiàn)Rh-123積聚水平的顯著升高.以上結(jié)果提示和厚樸酚對耐藥細(xì)胞P-gp功能無直接的抑制作用. 1.2 和厚樸酚對耐藥細(xì)胞P-gp及mdrl mRNA表達(dá)水平的影響 和厚樸酚分別處理MCF-7/ADR細(xì)胞12,24,48與72 has后,我們采用流式細(xì)

7、胞儀檢測細(xì)胞P-gp表達(dá)的變化情況.結(jié)果顯示,隨著和厚樸酚處理時(shí)間的延長,細(xì)胞表面P-gp的表達(dá)逐步下降,其呈時(shí)間依賴性下調(diào)細(xì)胞P-gp表達(dá).隨后,進(jìn)一步的研究顯示和厚樸酚也可呈劑量依賴性下調(diào)細(xì)胞P-gp表達(dá).進(jìn)而我們采用Real-time PCR檢測MCF-7/ADR細(xì)胞mdrl mRNA表達(dá)水平的變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)和厚樸酚同樣可呈劑量依賴性下調(diào)細(xì)胞mdrl mRNA表達(dá). 1.3 和厚樸酚對于MCF-7/ADR細(xì)胞Rh-123

8、積聚和外排的作用 我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞對Rh-123積聚與外排水平.結(jié)果發(fā)現(xiàn),用5.2μg/ml(約20μM)濃度的和厚樸酚處理過48小時(shí)的MCF-7/ADR耐藥細(xì)胞對于Rh-123的積聚水平明顯高于空白對照組細(xì)胞,Rh-123的外排水平則明顯低于空白對照.和厚樸酚可以增加MCF-7/ADR細(xì)胞對Rh-123的積聚并減少外排. 1.4 和厚樸酚可部分恢復(fù)MCF-7/ADR細(xì)胞對于阿霉素的敏感性 MTT檢

9、測結(jié)果顯示,經(jīng)過5.2μg/ml濃度的和厚樸酚預(yù)處理后,MCF-7/ADR細(xì)胞對阿霉素的敏感性顯著提高:細(xì)胞對阿霉素的IC50從17.7±4.9μg/ml(無預(yù)處理組)下降至6.2±1.9μg/ml(預(yù)處理組),降低了將近3倍.1.5 和厚樸酚預(yù)防阿霉素誘導(dǎo)引起的腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生的作用 我們選取了和厚樸酚、姜黃素、五味子乙素等數(shù)種天然藥物單體進(jìn)行本部分的實(shí)驗(yàn).結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)和厚樸酚預(yù)處理后,并不能有效地抑制阿霉素誘導(dǎo)引起的K56

10、2敏感細(xì)胞mdrl mRNA與P-gp表達(dá)水平上調(diào),兩者的表達(dá)水平與單用阿霉素誘導(dǎo)組細(xì)胞相比無明顯差異. 2.和厚樸酚與化療藥物聯(lián)用后聯(lián)合效應(yīng)的分析與增敏作用研究 2.1 利用聯(lián)合指數(shù)(CI)分析和厚樸酚與化療藥物的聯(lián)合效應(yīng) 通過CI的計(jì)算,我們發(fā)現(xiàn)除VP-16與和厚樸酚聯(lián)合處理MCF-7細(xì)胞組外,其余處理組不論是耐藥腫瘤細(xì)胞還是非耐藥細(xì)胞,經(jīng)藥物聯(lián)合處理后均能產(chǎn)生一定程度的協(xié)同效應(yīng);且對于耐藥細(xì)胞組協(xié)同效應(yīng)

11、較非耐藥細(xì)胞組明顯. 2.2利用劑量下降指數(shù)(DRI)研究和厚樸酚對化療藥物的增敏作用 我們通過劑量降低指數(shù)(DRI)的計(jì)算來反映出加用固定濃度的和厚樸酚后,在殺傷腫瘤細(xì)胞效果不變的前提下化療藥物濃度可以降低的倍數(shù).結(jié)果發(fā)現(xiàn),除VP-16處理MCF-7細(xì)胞組外,其余處理組不論是耐藥腫瘤細(xì)胞還是非耐藥細(xì)胞經(jīng)加用固定濃度的和厚樸酚外,均能明顯增敏相應(yīng)化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的效果,DRI提高明顯. 3.和厚樸酚聯(lián)合阿霉素

12、治療荷耐藥腫瘤細(xì)胞移植瘤裸鼠的體內(nèi)藥效研究 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),和厚樸酚可增強(qiáng)阿霉素抑制MCF-7/ADR耐藥細(xì)胞移植瘤體積增長的作用,聯(lián)合用藥后18天時(shí)移植瘤平均瘤體體積比單用阿霉素組減小約21.71﹪,差異有顯著性(P<0.05);同時(shí),和厚樸酚聯(lián)合阿霉素應(yīng)用還可延長荷瘤裸鼠的平均生存時(shí)間. 研究結(jié)論: 1.和厚樸酚可逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥,從而部分恢復(fù)耐藥腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性:和厚樸酚可能是通過降低