RANK-RANKL在損傷足細胞中表達及意義的研究.pdf

1、研究背景:
　　 足細胞(podocyte)和蛋白尿幾乎涉及了所有腎小球疾病。足細胞作為腎小球固有細胞之一，附著于腎小球基底膜(glomerularbasementmembrane，GBM)的外側，連同GBM和毛細血管內皮細胞一起，構成腎小球血液濾過的最后屏障。涉及此屏障的任何改變都可導致蛋白尿的發(fā)生。研究均證實蛋白尿的多寡以及持續(xù)時間均直接關系腎臟疾病的預后。作為血液濾過的最后屏障，足細胞已經(jīng)成為針對蛋白尿研究的關鍵細胞[1]

2、。足細胞脫落、凋亡以及隨后足細胞數(shù)目減少是導致蛋白尿持續(xù)發(fā)生和疾病進展的重要原因，從某種意義上講闡明了足細胞損傷的分子機制就有可能有效的阻止甚至逆轉蛋白尿的發(fā)生。
　　 正常足細胞受損后可引起濾過屏障功能的改變，導致蛋白尿的發(fā)生。特別是在膜性腎病、微小病變型腎病及局灶性腎小球硬化(FSGS)已證明與足細胞的原發(fā)性及繼發(fā)性損傷有關[2]。足細胞可被嘌呤核苷、各種抗體、補體及血流動力學等因素損害。病理狀態(tài)下，足細胞在各種致?lián)p傷因素作

3、用下可以發(fā)生非形態(tài)學的改變如足細胞特異蛋白分子（Nephrin，Podocin等）的下調和足細胞細胞骨架成分的變化等，也可發(fā)生形態(tài)學的改變如足突融合、細胞肥大、細胞凋亡等。許多因素如嘌呤霉素氨基核苷、TGFβ和AngⅡ等，都可以誘發(fā)足細胞的凋亡[3]。已證實在嘌呤霉素氨基核苷腎病大鼠模型和TGFβ轉基因小鼠腎小球內都存在足細胞凋亡。Petermann等[4]把Heymann腎炎模型大鼠尿中的細胞用來培養(yǎng)，細胞仍可貼壁存活，且證實這些細胞

4、主要是足細胞，說明活的足細胞可以從GBM脫落并從尿中排出;同時也提示除細胞凋亡外，足細胞脫落可能還存在其它原因，如GBM被MMPs或組織蛋白酶等降解破壞，或GBM被活性氧氧化損傷，或足細胞骨架蛋白發(fā)生重組，這些都可以削弱足突與GBM的粘附連接，導致細胞從GBM上剝離、脫落。
　　 足細胞作為一種終末分化細胞，足細胞在腎臟發(fā)育的S期退出增殖周期，呈現(xiàn)靜止狀態(tài)。在以足細胞損傷為主的腎小球疾病，如膜性腎病、微小病變病和原發(fā)性FSGS中

5、，足細胞損傷缺失后不能再生，GBM裸露的區(qū)域只能依靠其周邊細胞的代償肥大去填補。當周邊足細胞肥大失代償或腎小球過度增生肥大，肥大的足細胞也不能完全覆蓋GBM時，失去了足細胞支撐的GBM就會在毛細血管靜水壓的作用下，受壓凸向腎小囊，進而與腎小球壁層上皮細胞粘連，造成細胞增生、損傷和細胞外基質成分的沉積，最終形成腎小球硬化[5]。
　　 足細胞在損傷過程中，足細胞為了適應環(huán)境變化，足細胞產生異常蛋白以保護足細胞，避免足細胞損傷加重。

6、如病毒感染可以引起塌陷型FSGS，此類病變的足細胞具有細胞增生的表型。增生表型的出現(xiàn)常見于細胞高度去分化情況下，足細胞去分化包括細胞形態(tài)的改變及突起的丟失，細胞骨架成分的丟失尤其是肌動蛋白為主的骨架蛋白，尚有許多足細胞特異性蛋白如WT1，Synaptopodin，GLEPP1等表達缺失[6-7]。
　　 既往研究發(fā)現(xiàn)細胞核因子κB受體活化因子RANK(ReceptoractivatorofNF-KB)及其配基RANKL(Rece

7、ptoractivatorofNF-KBligand)是近年來發(fā)現(xiàn)的一對細胞因子，為腫瘤壞死因子(TNF)及其受體超家族成員之一[8]。RANKL是破骨細胞分化、發(fā)育和成熟過程中起關鍵性作用的細胞因子。RANKL與其特異性受體RANK結合，可促進破骨細胞分化。骨保護素(OPG)可以調節(jié)這一旁路，通過與RANK的結合，將阻止RANKL與RANK結合進而抑制破骨細胞分化。OPG—RANKL—RANK信號傳導途徑如下:OPG是RANKL和TN

8、F相關誘導凋亡配基(TRAIL)的誘騙(decoy)受體，可競爭性阻斷RANKL與RANK結合，抑制RANKL發(fā)揮其相應作用。當RANKL和RANK的結合后，再募集TNF受體相關因子(TRAFs)，后者通過特化的效應域激活核轉錄因子κB(NF-κB)或分裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)。MAPKs是一組包括多種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的家族，有ERK、P38、JNK等途徑，并進一步參與調節(jié)細胞MMP活性。NF-κB為OPG/RANKL/R

9、ANK的信號傳導的下游分子，能促進細胞因子的分泌，并調節(jié)細胞的生存、凋亡、分化及活化等[9-10]。
　　 既往對RANK-RANKL系統(tǒng)的研究主要集中在骨質疏松及骨腫瘤性疾病中。近年來，研究發(fā)現(xiàn)RANK-RANKL系統(tǒng)不僅參與淋巴細胞的發(fā)育及淋巴器官的形成，而且還可在胚胎腎臟、肌成纖維細胞、血管內皮細胞、乳腺上皮細胞、外周單個核細胞及胃癌等細胞中表達，該系統(tǒng)尚參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[11-14]。
　　 在足細胞

10、損傷的動物模型中，是否存在RANK-RANKL的異常，尚無文獻報道。為了驗證上述假說，本研究應用PAN誘導的動物模型、5/6腎切除動物模型及人類腎小球疾病中，觀察RANK和RANKL表達，并體外培養(yǎng)足細胞，分析RANKL對足細胞凋亡的影響;通過RANK的siRNA技術轉染條件永生性小鼠足細胞實現(xiàn)RANK基因沉默，觀察RANK基因沉默后RANKL對足細胞凋亡的影響，初步探討RANK和RANKL異常表達在足細胞損傷和腎小球硬化中的作用。

11、r>　　 研究目的:
　　 1.在足細胞損傷的動物模型中，是否存在RANK-RANKL的異常表達？
　　 2.RANK-RANKL的異常高表達對足細胞的影響。
　　 研究方法:
　　 一、嘌呤霉素氨基核苷(PAN)對足細胞的影響
　　 （一）PAN動物模型的制作:36只性SD大鼠隨機分為正常對照組(Con)、模型組(PAN)，每組18只。嘌呤霉素氨基核苷(PAN)溶入生理鹽水配制成50mg/ml

12、4度保存。PAN組單次尾靜脈注射PAN100mg·kg-1，建立PAN足細胞損傷動物模型，Con組給予等量的生理鹽水注射。于3、7及14天分三批處死動物，每次6只，分別檢測不同時間點24小時尿蛋白、腎功能。（二）24小時尿蛋白及腎組織學的觀察:大鼠于3、7和14天分三批處死動物，每次6只，分別檢測不同時間點24小時尿蛋白、腎功能;HE和PAS染色及透射電鏡觀察腎組織學改變。
　　 （三）RANK、RANKL、Nephrin等表達

13、的觀察:分別用激光共聚焦(Confocal)、Westernblot和RT-PCR技術觀察RANK、RANKL、Nephrin表達和分布。
　　 二、5/6腎切除動物模型中RANK-RANKL的表達
　　 （一）5/6腎切除動物模型的建立:中山醫(yī)科大學實驗動物中心提供的SpragueDauley大鼠36只，體重150～200g，隨機分為5/6腎切除模型組及假手術組各18只。大鼠第二次手術后，5/6腎切除模型組及假手術組。

14、
　　 （二）24小時尿蛋白、生化指標及腎組織學的觀察:各組大鼠分別于4、8、12周殺檢，第4、8、12周各殺6只，分別檢測不同時間點24小時尿蛋白、腎功能和電解質，光鏡和透射電鏡觀察腎組織學改變。
　　 （三）RANK及RANKL表達的檢測:RT-PCR檢測RANK及RANKLmRNA的表達、免疫組化分別檢測RANK及RANKL。
　　 （四）Westernblot檢測RANK及RANKL蛋白。
　　

15、三、人類腎小球疾病中RANK的表達
　　 （一）正常腎組織取自于腎癌手術切除標本。MN、IgA腎病、FSGS標本取自于本科腎活檢標本，行腎臟病理檢測。
　　 （二）腎臟病理免疫熒光檢測RANK及Synaptopodin。
　　 四、嘌呤霉素氨基核苷(PAN)對足細胞的影響
　　 （一）條件永生性足細胞的培養(yǎng)及誘導:條件永生性小鼠足細胞由Baylor醫(yī)學院Danesh教授惠贈。首先在33℃20u/mlINF

16、-γ1640培養(yǎng)基，Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶，使細胞增殖，轉入37℃無INF-γ的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-14d誘導分化，經(jīng)鑒定表達Nephrin和Synaptopodin的細胞為分化成熟足細胞。
　　 （二）PAN誘導足細胞RANK表達。
　　 （三）RANKL對PAN誘導足細胞凋亡影響。
　　 （四）RANK基因沉默對足細胞的影響。
　　 （五）RANKL對足細胞鈣離子濃度及足細胞caK電流的影響。

17、r>　　 五、統(tǒng)計學方法:
　　 所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示。根據(jù)不同的資料，使用相應的統(tǒng)計學方法，用PEMS3.1統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 一、嘌呤霉素氨基核苷(PAN)對足細胞的影響
　　 （一）PAN誘導的PAN大鼠逐漸出現(xiàn)大量蛋白尿、大量腹水和低蛋白血癥呈典型腎病綜合征的表現(xiàn)，并出現(xiàn)腎功能損害。病理呈現(xiàn)腎間質水腫、炎癥細胞浸潤、大量的蛋白管型

18、及局灶節(jié)段性腎小球硬化及部分腎小管萎縮和纖維化。PAN組腎病大鼠精神狀態(tài)差，出現(xiàn)大量腹水，并出現(xiàn)大量蛋白尿等典型的腎病綜合征的表現(xiàn)。與對照組相比PAN組7天的動物24h尿蛋白顯著增多[(135±29)mgvs(6.15±0.68)，P＜0.05]，血肌酐水平顯著增加[(49±5.87)μmol/Lvs(36.17±1.83)μmol/L,P＜0.05]。
　　 （二）PNA注射3天，見腎小球及腎間質有大量的淋巴細胞浸潤;PAN腎

19、病大鼠7天時，出現(xiàn)足突廣泛融合、容酶體壞死，腎間質水腫。免疫電鏡結果顯示:對照組RANK表達量少;PAN組RANK表達明顯增加，主要分布在足細胞的足突胞膜和胞質內。
　　 （三）RANK及RANKL的表達和定位
　　 正常組大鼠RANKmRNA及蛋白低水平表達，PAN刺激后RANK表達顯著升高。激光共聚焦顯示RANK在PAN模型7天時表達最強，分布最廣，而且與足細胞標志蛋白Synaptopodin高度融合，提示RANK的

20、表達主要在足細胞上。正常組大鼠RANKLmRNA及蛋白處在較低水平，PAN刺激后也顯著升高。
　　 二、5/6腎切除動物模型中RANK-RANKL的表達
　　 （一）尿蛋白、腎功能及腎臟病理變化
　　 與假手術組相比，大鼠5/6腎切除術后4周出現(xiàn)蛋白尿、血肌酐升高，隨著腎衰時間的延長，24h尿蛋白含量和血肌酐濃度逐漸增高。5/6腎切除組，第4周腎小球增大不明顯，有輕度的系膜細胞增殖和基質增寬。第12周系膜重度增生

21、伴中、重度系膜硬化，普遍存在纖維素樣滲出和球囊粘連。
　　 （二）腎臟RANK及RANKL高表達
　　 免疫組化、RT-PCR及Western-blot檢測RANK及RANKL，結果顯示RANK及RANKL在硬化組明顯增加，而假手術組低表達。
　　 三、在人類腎小球疾病中RANK的表達
　　 （一）IgA腎病14例，膜性腎病16例，F(xiàn)SGS12例。FSGS患者的腎臟病理結果，PAS染色可以見到節(jié)段性腎小球

22、硬化，膜性腎病的六胺銀染色結果，可以見到釘突。
　　 （二）共聚焦顯微鏡顯示:對照組RANK低水平表達，而在IgA腎病、MN及FSGS組腎臟中，RNAK表達明顯增多，足細胞標志蛋白Synaptopodin與RANK高度重疊，在FSGS的硬化區(qū)域RANK低表達。
　　 四、嘌呤霉素氨基核苷(PAN)對足細胞的影響
　　 （一）足細胞在33℃INF-γ的作用下呈鵝卵石樣外表;轉入37℃無INF-γ培養(yǎng)10-14天分化

23、為星狀有突起的足細胞，分化狀態(tài)下的足細胞表達Synaptopodin及Nephrin。
　　 （二）PAN誘導RANK表達
　　 PAN刺激足細胞的表達RANK，RANK主要在胞漿及胞膜部位表達。
　　 （三）RANKL對PAN誘導的足細胞凋亡的效果
　　 RANKL對足細胞凋亡的濃度效應和時間效應。
　　 （四）RANK基因沉默對足細胞的影響
　　 RANK+/+足細胞F-actin成絲

24、狀，放射狀排列，RANK基因沉默后F-actin的形態(tài)與RANK+/+足細胞無明顯區(qū)別;PAN50μg/ml刺激后RANK+/+足細胞體積縮小F-actin聚集、絲狀結構不明顯;與RANK+/+細胞比RANK-/-足細胞PAN50μg/ml刺激后F-actin收縮更為顯著。RANKL預處理后，再用PAN刺激，RANK+/+足細胞骨架蛋白病變程度較輕，RANK-/-足細胞經(jīng)RANKL預處理后用PAN刺激12h骨架蛋白形態(tài)與沒有預處理組比無

25、明顯改善。
　　 （五）RANKL對足細胞鈣離子濃度及足細胞Kca電流等的影響
　　 我們的結果顯示RNAKL降低足細胞內鈣，但在PAN刺激下細胞內鈣離子濃度顯著升高。當細胞受到外界有害刺激時細胞內鈣濃度瞬間急驟升高，導致細胞的損傷。RANL(40ng/ml)對Kca電流有明顯抑制作用，電流密度從(9.03±1.42)pA/pF減少到(7.12±0.52)pA/pF(n=7，P＜0.05)，先給予thapsigargin

26、(TG)處理后，再加RANKL，則可以消除RANKL對Kca電流的抑制作用，提示RANKL對Kca的作用為間接作用。PAN降低Ca2+-ATP酶，RANKL升高Ca2+-ATP酶，Tg則抑制Ca2+-ATP酶;RANKL升高Ca+-ATP酶，并且與濃度有關，RANKL濃度越高，則Ca2+-ATP酶的活性越高。
　　 結論:
　　 一、嘌呤霉素氨基核苷足細胞損傷動物模型中，RANK-RANKL高表達，RANK主要表達在足細

27、胞。
　　 二、5/6腎切除動物模型中，腎臟組織高表達RANK-RANKL，并且高表達主要在足細胞上，提示RANK/RANKL在足細胞損傷中有重要價值。
　　 三、正常足細胞上RANK表達低水平，在IgA腎病、MN及FSGS人類腎小球疾病中，RNAK明顯增加，足細胞標志蛋白Synaptopodin與RANK高度重疊，提示RNAK主要在足細胞表達，并且在FSGS的硬化區(qū)域RANK低表達。
　　 四、嘌呤霉素氨基核苷