PMA+Iono和Z-VRPR-FMK對(duì)侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.pdf

1、目的：用MALT1激動(dòng)劑PMA+Iono和MALT1抑制劑Z-VRPR-FMK刺激 DLBCL和Burkitt淋巴瘤細(xì)胞，檢查培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)活力、凋亡和細(xì)胞周期變化，檢查細(xì)胞內(nèi)MALT1和A20蛋白。探討PMA+Iono和Z-VRPR-FMK對(duì)兩種淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其與MALT1和A20蛋白異常的關(guān)系，為發(fā)現(xiàn)侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤治療的新靶點(diǎn)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:培養(yǎng)DLBCL細(xì)胞株OCI-LY1，OCI-LY8和Bur

2、kitt淋巴瘤細(xì)胞株Raji，在培養(yǎng)細(xì)胞中加入MALT1激動(dòng)劑PMA+Iono和特異性的抑制劑Z-VRPR-FMK；MTT法檢查不同濃度、不同時(shí)間PMA+Iono和Z-VRPR-FMK處理的細(xì)胞代謝生長(zhǎng)情況；利用蛋白印記檢測(cè)MALT1和A20蛋白；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期變化情況。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：1. PMA+Iono和Z-VRPR-FMK對(duì)OCI-LY8細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：培養(yǎng)24h，當(dāng)培養(yǎng)基中Iono

3、濃度小于1μM時(shí)，加入10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml濃度的PMA+Iono，OCI-ly8細(xì)胞生長(zhǎng)與對(duì)照組無明顯差異，P均大于0.05。Iono濃度等于1μM時(shí)，加入10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml濃度的PMA+Iono時(shí)OCI-ly8細(xì)胞OD值（0.135±0.009、0.126±0.019、0.123±0.027）明顯低于對(duì)照組（0.173±0.032），P均小于0.05。培養(yǎng)48h和72h，培養(yǎng)基

4、中加入9種濃度的PMA+Iono（10ng/ml+125ng/ml、50ng/ml+125ng/ml、100ng/ml+125ng/ml、10ng/ml+0.5μΜ、50ng/ml+0.5μΜ、100ng/ml+0.5μΜ、10ng/ml+1μΜ、50ng/ml+0.5μΜ、100ng/ml+0.5μΜ），細(xì)胞OD值均低于0.200，明顯低于相應(yīng)對(duì)照組（48h：0.336±0.035，72h：0.805±0.079），P均小于0.05；

5、相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：PMA濃度固定為10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml時(shí)，培養(yǎng)48h和72h時(shí)Iono濃度與OCI-ly8細(xì)胞生長(zhǎng)均成負(fù)相關(guān)關(guān)系，r和P依次為：48h：（-0.820，0.000）、（-0.782，0.001）和（-0.878，0.000）；72h：（-0.800，0.000）、（-0.868，0.000）和（-0.919，0.000）；加入25μΜ、50μΜ、75μΜ、100μΜ的Z-VRPR-FMK培養(yǎng)細(xì)胞2

6、4h、48h、72h，OCI-LY8細(xì)胞的OD值與相應(yīng)對(duì)照組相比均無明顯差異，P均大于0.05。2. PMA+Iono和Z-VRPR-FMK對(duì)OCI-LY1和Raji細(xì)胞MALT1和A20蛋白表達(dá)的影響：（1）OCI-LY1細(xì)胞：?jiǎn)为?dú)加入不同濃度（200ng/ml+0、200ng/ml+125ng/ml、200ng/ml+1μM、200ng/ml+2μM）的PMA+Iono作用2h和200ng/ml+1μM的PMA+Iono作用0.5h

7、、2h、6h，OCI-LY1細(xì)胞內(nèi)的MALT1蛋白表達(dá)與相應(yīng)對(duì)照組之間沒有明顯差異，P均大于0.05。而不同濃度的PMA+Iono處理后A20蛋白相對(duì)表達(dá)量依次為2.44±0.77、3.09±0.74、4.35±0.74、5.01±1.06，后三組明顯高于對(duì)照組，P值依次為0.118、0.021、0.001、0.000。不同作用時(shí)間的PMA+Iono處理后A20蛋白相對(duì)表達(dá)量依次為2.08±0.27、2.36±0.21、3.45±0.2

8、6，都明顯高于對(duì)照組，P值依次為0.001、0.000、0.000。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)A20蛋白表達(dá)與PMA+Iono作用的濃度和時(shí)間都有正相關(guān)關(guān)系，（r，P）分別為（0.911,0.000）和（0.959,0.000）；加入不同濃度（25μM、50μM、75μM）的Z-VRPR-FMK和75μM的Z-VRPR-FMK作用0.25h、0.5h、2h，MALT1和A20蛋白表達(dá)與相應(yīng)對(duì)照組之間未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P均大于0.05；同濃度同時(shí)

9、間的PMA+Iono分別與不同濃度同時(shí)間的Z-VRPR-FMK和同濃度不同時(shí)間Z-VRPR-FMK處理細(xì)胞，MALT1和A20蛋白表達(dá)與相應(yīng)對(duì)照組之間均無明顯差異，P均大于0.05。（2）Raji細(xì)胞：?jiǎn)为?dú)、加入PMA+Iono及同時(shí)加入PMA+Iono和Z-VRPR-FMK，其MALT1蛋白與對(duì)照組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P均大于0.05；上述處理后細(xì)胞內(nèi)A20蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組。固定PMA+Iono濃度與時(shí)間處理細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)A20蛋

10、白表達(dá)隨著加入Z-VRPR-FMK濃度的增加而增高，固定 PMA+Iono濃度與時(shí)間及 Z-VRPR-FMK濃度處理細(xì)胞，A20蛋白也隨著Z-VRPR-FMK刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而表達(dá)增高，都有明顯的濃度、時(shí)間的正相關(guān)關(guān)系，（r，p）分別為（0.928,0.000）和（0.937,0.000）。3. PMA+Iono和Z-VRPR-FMK對(duì) OCI-LY1細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)中加入 PMA+Iono處理48h細(xì)胞凋亡數(shù)(

11、25.5±8.84)明顯多于對(duì)照組（7.43±1.42），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸增加；加入Z-VRPR-FMK凋亡率在24h、48h、72h與相應(yīng)對(duì)照組間均無明顯差異。4. PMA+Iono和Z-VRPR-FMK對(duì)OCI-LY1細(xì)胞細(xì)胞周期的影響：加入PMA+Iono處理24h和48h，處于S期的OCI-LY1細(xì)胞百分率（依次為19.17±3.01、23.17±5.03）顯著低于相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞（36.26±8.54、33.50±

12、5.10），P均小于0.05，處理72h則處于G2-M期的細(xì)胞百分率（7.05±1.75）明顯高于對(duì)照組（2.65±0.83），P亦小于0.05。
　　結(jié)論：1．PMA+Iono能夠抑制 DLBCL細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，其作用可能與細(xì)胞內(nèi) A20蛋白的表達(dá)有關(guān)。2．Burkitt細(xì)胞內(nèi)存在 MALT1蛋白水解酶活性的增高，MALT1可能是 Burkitt淋巴瘤治療的新靶點(diǎn)。3. GCB樣DLBCL細(xì)胞沒有MALT1蛋白水解酶活性的增高，