淫羊藿總黃酮調(diào)控HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞凋亡和再生的研究.pdf

1、背景：超過(guò)生理劑量的糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期應(yīng)用造成下丘腦一垂體一腎上腺(HPA)軸抑制和腎上腺皮質(zhì)萎縮。突然停藥之后，易致腎上腺皮質(zhì)功能不全，對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定甚至是生命存在潛在的威脅，為避免疾病復(fù)發(fā)和促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)功能恢復(fù)，劑量遞減仍是臨床采用的唯一方法，但需要幾個(gè)月甚至是1年以上的時(shí)間。因此，尋找新的方法拮抗糖皮質(zhì)激素對(duì)HPA軸的抑制，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)功能恢復(fù)，是臨床醫(yī)學(xué)需要解決的重要命題。 腎上腺皮質(zhì)功能有賴(lài)于腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和功

2、能。研究表明腎上腺皮質(zhì)外側(cè)存在干細(xì)胞，腎上腺皮質(zhì)干細(xì)胞在外側(cè)增殖、并向內(nèi)側(cè)遷移和分化從而形成腎上腺皮質(zhì)各個(gè)功能層，依次為球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶，這種腎上腺皮質(zhì)再生和另一個(gè)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞凋亡共同調(diào)節(jié)了腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和功能。因此本研究擬從兩個(gè)方面研究盯的作用機(jī)制。 目的：1、盯對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)HPA軸受抑大鼠。腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞過(guò)度凋亡的影響及分子機(jī)制。2、EF對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質(zhì)再生的影響及分子機(jī)制。

3、 材料與方法：動(dòng)物：動(dòng)物采用清潔級(jí)SD大鼠，雄性，4月齡。藥物：盯采用遼寧產(chǎn)朝鮮淫羊藿，由上海市醫(yī)藥工業(yè)研究院中藥室提取。 方法：分為正常對(duì)照組、模型組、治療組。模型組皮下注射皮質(zhì)酮每天5mg／kg，連續(xù)14天。治療組用EF灌胃，于造模前5天開(kāi)始灌胃直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，劑量為每天0．06g／kg。①采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫分析方法檢測(cè)大鼠血漿皮質(zhì)酮水平，以評(píng)價(jià)盯治療對(duì)HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質(zhì)功能的保護(hù)效果。②檢測(cè)大鼠腎上腺重量和采用

4、HE染色對(duì)大鼠腎上腺皮質(zhì)進(jìn)行組織學(xué)觀察，以觀察盯防治腎上腺萎縮的效果。③兩種方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分離的腎上腺細(xì)胞凋亡率；并采用末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的X—dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)原位細(xì)胞凋亡。④兩種方法檢測(cè)細(xì)胞增殖，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布；大鼠處死前1天腹腔注射BrdU，取。腎上腺，BrdU免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)處于DNA合成期的細(xì)胞。⑤造模前l(fā)天大鼠腹腔注射BrdU以標(biāo)記增殖細(xì)胞，14天后取腎上腺，采用B

5、rdU免疫組織化學(xué)染色法觀察增殖細(xì)胞的遷移情況；⑥采用基因芯片和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究EF對(duì)細(xì)胞凋亡、增殖等過(guò)程發(fā)揮作用的分子機(jī)制。 結(jié)果：l、各組大鼠血漿皮質(zhì)酮水平：正常對(duì)照組、模型組、治療組血漿皮質(zhì)酮水平分別為：96．03+30．95ng／mI(n=16)、30．72+21．73ng／ml(n=16)、53．79±25．63ng／mI(n=24)，模型組和正常對(duì)照組比較，血漿皮質(zhì)酮水平顯著減低(P

6、比較，血漿皮質(zhì)酮水平升高(P

7、常對(duì)照組、模型組、治療組細(xì)胞凋亡率分別為7．91±6．063％、M．42±4．851％、8．62±5．59％，模型組與正常對(duì)照組比較顯著升高(P

8、能明顯降低皮質(zhì)酮大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞過(guò)度的細(xì)胞調(diào)亡。 4、細(xì)胞增殖檢測(cè)：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布結(jié)果示正常對(duì)照組、模型組、治療組處于GO／G1期細(xì)胞比例分別為76．36±L93％、93．40±1．70％、85．70±2．62，與正常對(duì)照組比較，模型組顯著升高(P

9、照組比較，模型組顯著降低(p

10、BrdU，對(duì)處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，這些標(biāo)記細(xì)胞隨時(shí)間而遷移。以球狀帶和束狀帶的分界為界線，14天之后，BrdU免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示正常對(duì)照組和模型組的標(biāo)記細(xì)胞均位于球狀帶，治療組絕大部分標(biāo)記細(xì)胞位于束狀帶／網(wǎng)狀帶。表明EF能促進(jìn)被標(biāo)記的增殖細(xì)胞向內(nèi)側(cè)遷移。 6、EF減輕細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞周期、促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌功能的分子機(jī)制：采用美國(guó)Affymetrix公司Ratexpression2302．O基因芯片，基因差異表達(dá)(

11、上調(diào)或下調(diào))兩倍以上為有意義。發(fā)現(xiàn)模型組與正常對(duì)照組比較，上調(diào)的基因29個(gè)，下調(diào)的基因785個(gè)，反映皮質(zhì)酮主要抑制腎上腺基因表達(dá)。其中有3個(gè)為凋亡相關(guān)基因：AMP-activatedproteinkinasealpha1catalyticsubunit、inhibitorofapoptosisprotein1、baculox~irallAPrepeat．Containing4，均具有抗凋亡活性；參與細(xì)胞周期的基因有6個(gè)，分別是neuro

12、blastomaRASviral(v-ras)oncogenehomolog、nuclearfactorFA、forkheadbox01、V-junsarcomavims17oncogenehomolog(avian)、fibroblastgrowthfactor7(FGF7)、intefieukin1alpha，均具促進(jìn)細(xì)胞周期活性。治療組與模型組比較，上調(diào)的基因有237個(gè)，下調(diào)的基因有122個(gè)。其中有2個(gè)具抗凋亡活性的基因上調(diào)：mi

13、togenactivatedproteinkinase8interactingprotein、insulin-likegrowthfactorII(IGF．II)；有6個(gè)是促進(jìn)細(xì)胞周期基因：FGF7、IGF．II、mismatchrepairprotein、retproto-oncogene、v-junsarcomavirus17oncogenehomolog(avian)、prostaglandin-endoperoxidesynth

14、ase2；有7個(gè)與皮質(zhì)類(lèi)固醇合成相關(guān)的基因上調(diào)：mevalonatekinase、mevalonatepyrophosphatedecarboxylase、famesyldiphosphatefamesyltransferase1、isopentenyl-diphosphatedeltaisomerase、2,3-oxidosqualeneanosterolcyclase、cytochromeP450subfamily51、farens

15、yldiphosphatesynthase?；虮磉_(dá)皮質(zhì)再生具有重要作用?；虮磉_(dá)譜檢測(cè)結(jié)果顯示盯明顯上調(diào)IGF-II和FGF-7的mRNA表達(dá)，根據(jù)文獻(xiàn)，IGF和FGF家族與腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞表面受體結(jié)合后對(duì)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化、類(lèi)固醇合成多個(gè)過(guò)程均具有重要的調(diào)控作用，因此是調(diào)節(jié)。腎上腺皮質(zhì)再生的重要上游分子；我們對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步觀察，分離正常大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞，直接與EF溶液孵育，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)其基因表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與盯共同

16、孵育后，IGF—IImRNA表達(dá)顯著升高(PO．05)。綜合基因芯片和定量PCR結(jié)果，IGF—II和FGF7在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(基因芯片檢測(cè))mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)；并且IGF—IImRNA在體外實(shí)驗(yàn)(直接與EF溶液孵育)也被盯上調(diào)，表明IGF-Ⅱ和FGF-7均介導(dǎo)了EF的作用更為重要。 結(jié)論： 通過(guò)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，我們認(rèn)為EF能通過(guò)干預(yù)以下兩個(gè)細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制拮抗糖皮質(zhì)激素

17、對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能的抑制： 1、EF能減輕皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞過(guò)度凋亡。 2、EF能促進(jìn)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的HPA軸受抑大鼠腎上腺皮質(zhì)再生。根據(jù)大量文獻(xiàn)研究，BrdU標(biāo)記細(xì)胞可認(rèn)為是腎上腺皮質(zhì)干細(xì)胞，我們采用完全相同的方法，觀察到EF作用后BrdU標(biāo)記細(xì)胞增殖活躍；更多細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期；促進(jìn)BrdU標(biāo)記細(xì)胞向內(nèi)側(cè)遷移；多種類(lèi)固醇合成相關(guān)酶基因表達(dá)上調(diào)。綜上我們認(rèn)為盯干預(yù)了腎上腺皮質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化的各