人源輪狀病毒T細(xì)胞識別及其小型豬腹瀉模型的建立.pdf

1、A組輪狀病毒是造成全世界嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的最主要病原。最新統(tǒng)計資料表明，全世界5歲以下兒童每年約有1億3千8百萬患輪狀病毒感染，其中約454，000-705,000例死亡(82％的死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家)。目前，輪狀病毒尚無特效治療藥物及安全有效的預(yù)防性疫苗，對輪狀病毒感染的免疫保護(hù)機(jī)制的進(jìn)一步研究是當(dāng)前研究的重點與難點。 在小鼠輪狀病毒感染模型中的大量研究表明，TCRαβ+/+CD8+T細(xì)胞在抗輪狀病毒原發(fā)感染及再次感染中具有

2、重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在無輪狀病毒抗體的情況下，輪狀病毒感染的成年小鼠的CD8+T細(xì)胞可被動保護(hù)乳鼠，并且可介導(dǎo)重癥免疫缺陷小鼠清除慢性輪狀病毒感染；細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL)缺陷小鼠(β2-microglobulinknockoutmice)及其他封閉了CD8+T細(xì)胞的小鼠清除輪狀病毒感染的時間延遲1-4天；B細(xì)胞缺陷(J(H)D基因敲除)小鼠可清除輪狀病毒的原發(fā)感染，封閉CD8+T細(xì)胞后則

3、轉(zhuǎn)為慢性感染；B細(xì)胞缺陷小鼠原發(fā)感染18天后可介導(dǎo)幾乎完全的免疫保護(hù)，6周、5個月及8個月仍能介導(dǎo)部分的免疫保護(hù)，但封閉CD8+T細(xì)胞后，在原發(fā)輪狀病毒感染13天、18天、6周及5個月再次攻擊則會轉(zhuǎn)為輪狀病毒慢性感染，而封閉TCRγδ+/+T細(xì)胞幾乎無影響，表明TCRαβ+/+CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)了對輪狀病毒再次感染的免疫保護(hù)。進(jìn)一步研究顯示，輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP6與VP7是其CTL效應(yīng)的主要靶標(biāo)。VP6是輪狀病毒的組抗原，其含量占輪狀病

4、毒蛋白總量的51％，同組輪狀病毒VP6的氨基酸序列高度保守(87-99％)；VP7是輪狀病毒主要的外殼結(jié)構(gòu)蛋白，約占病毒蛋白總量的30％，與此同時，VP7不但可引起極強(qiáng)的CTL效應(yīng)，并且與輪狀病毒不同血清型具有完全的交叉反應(yīng)。盡管現(xiàn)已有猴源輪狀病毒SA11(G3)及牛源輪狀病毒UK(G6)的鼠源限制性CTL表位鑒定方面的報道，但均不能用于人體內(nèi)輪狀病毒感染中CD8+T細(xì)胞的研究。目前，CD8+T細(xì)胞在人體內(nèi)輪狀病毒感染中的地位與作用如何

5、，尚不明了。至今尚未見輪狀病毒HLA-Ⅰ類限制性CTL表位鑒定方面的報道，這在一定程度上阻礙了人體內(nèi)輪狀病毒感染中CD8+T細(xì)胞的相關(guān)研究。既往研究還表明，G1血清型是全世界所有輪狀病毒流行株中最主要的流行血清型，在中國、北美洲、歐洲和澳大利亞等地區(qū)，G1血清型超過了70％；HLA-A2是所有人種中最普遍的HLA表型，其中HLA-A2.1是其優(yōu)勢表型，如在白種人中，HLA-A2.1占HLA-A2的90％以上。 大量關(guān)于輪狀病毒感

6、染的免疫保護(hù)機(jī)制研究均用實驗小鼠作為動物模型，但其本身存在很大局限，如人源輪狀病毒對其不敏感、輪狀病毒致腹瀉的敏感期特別短(出生后約15天)、小鼠本身不同品系的影響及病理進(jìn)程的差異等。因此，用實驗小鼠作為模型對輪狀病毒的研究只能起到有限的參考。大型動物如牛、豬對人源輪狀病毒相對敏感，感染后可致臨床腹瀉癥狀，同時致腹瀉的敏感期長(豬出生后可長達(dá)6周)。相對于其它動物模型，以豬作為輪狀病毒的感染模型還具有如下優(yōu)勢：1)具有和嬰幼兒相似的消化

7、道生理學(xué)特征、被動免疫類型(母乳IgA)與免疫發(fā)生過程；2)豬的胎盤是母源抗體的天然屏障，出生時無初乳喂養(yǎng)小豬的免疫狀態(tài)就象一片處女地，便于研究輪狀病毒感染后的原發(fā)免疫反應(yīng)。國外有用悉生豬(Gnotobioticpiglets，GnP)作為輪狀病毒感染模型方面的研究報道，并取得了較大進(jìn)展。但因其飼養(yǎng)費(fèi)用昂貴，繁殖能力弱，作為實驗動物其基因純合度低等因素，限制了在輪狀病毒研究中的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用。小型豬是我國自行選育的特有品種，又稱微型豬。

8、它在分類學(xué)上與普通家豬相同，同屬豬屬動物，野豬科。我國小型豬品種資源豐富，同時大都原產(chǎn)于我國南方一些偏遠(yuǎn)的山區(qū)，長期的近親繁殖使其具有體型矮小、性成熟早、繁殖力強(qiáng)及基因純度高等優(yōu)點。因此，小型豬作為實驗動物受到了國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者的關(guān)注和重視。另一方面，CD8+T細(xì)胞在輪狀病毒感染的大型動物如豬體內(nèi)的地位與作用如何，腸粘膜及其他不同部位的CD8+T細(xì)胞功能狀態(tài)是否存在差異，目前尚不清楚。 基于以上研究背景，我們進(jìn)行了如下三方面的研究

9、：1)采用計算機(jī)軟件預(yù)測與體內(nèi)外功能實驗相結(jié)合的反向免疫學(xué)方法，鑒定人源輪狀病毒W(wǎng)a株(G1)VP6與VP7的HLA-A2.1限制性CTL表位；2)用我國自行選育的特有品種小型豬，建立人源輪狀病毒感染的腹瀉模型；3)用胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ染色，初步檢測小型豬人源輪狀病毒感染的腹瀉模型中，外周血及其他不同組織中CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的頻率。 在表位鑒定方面，本研究從以下幾方面進(jìn)行：首先，預(yù)測并測定肽與HLA-A2.1的結(jié)合

10、能力。應(yīng)用表位親和力預(yù)測軟件SYFPEITHI和BIMAS及蛋白酶切位點預(yù)測軟件PAProc和Fragpredict分別預(yù)測VP6與VP7HLA-A2.1限制性CTL表位，應(yīng)用分子模擬對候選肽進(jìn)行分子建模，體外肽/T2結(jié)合實驗檢測肽與HLA-A2.1的結(jié)合親和力與結(jié)合穩(wěn)定性。然后，檢測待測肽能否有效激活人T細(xì)胞庫中肽特異性T細(xì)胞前體以及能否被人體內(nèi)的細(xì)胞有效加工提呈。用待測肽負(fù)載的DC反復(fù)刺激自源性HLA-A2.1+的健康人外周血淋巴細(xì)

11、胞(periphebloodlymphocytes,PBL)，然后胞內(nèi)因子染色檢測IFN-γ產(chǎn)生頻率，標(biāo)準(zhǔn)51Cr檢測殺傷活性。最后，檢測輪狀病毒能否在體誘導(dǎo)產(chǎn)生待測肽特異性的CTL反應(yīng)。用輪狀病毒免疫HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠，ELISPOT及標(biāo)準(zhǔn)51Cr檢測效應(yīng)CTL的IFN-γ產(chǎn)生頻率及其殺傷活性。 我們的實驗結(jié)果表明，來源于VP6結(jié)構(gòu)蛋白的肽p340-348(TLLANVTAV)和VP7結(jié)構(gòu)蛋白的肽p18-26(L

12、LNYILKSV)與HLA-A2.1呈高親和力結(jié)合(FI2.66與3.83)，同時能形成穩(wěn)定的肽-HLA-A2.1復(fù)合物(DC50大于或等于8h)。體外功能實驗結(jié)果表明，HLA-A2.1+健康成年人的PBL能誘導(dǎo)產(chǎn)生很強(qiáng)的p340-348與p18-26特異性的.CTL反應(yīng)。p340-348誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL其產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T頻率分別達(dá)14.00％、8.07％及14.78％，同時能特異性殺傷p340-348負(fù)載的T2及輪狀病毒感染

13、的Caco-2(HLA-A2.1+)，其殺傷率分別為74％及42％(效/靶50:1)；p18-26刺激產(chǎn)生的CTL產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T頻率分別達(dá)20.15％及9.17％，特異性殺傷p18-26負(fù)載的T2及輪狀病毒感染的Caco-2的殺傷率分別達(dá)52％及37％(效/靶50:1)。同時，上述CTL的殺傷活性均能被抗HLA-A2.1的單克隆抗體有效抑制。HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠的體內(nèi)功能實驗結(jié)果表明，輪狀病毒能在體誘導(dǎo)產(chǎn)生p34

14、0-348與p18-26特異性的CTL反應(yīng)。在體誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL具有劑量依賴性的IFN-γ產(chǎn)生能力及肽特異性的殺傷。以上實驗結(jié)果表明，p340-348與p18-26為輪狀病毒的HLA-A2.1限制性CTL表位。此表位的鑒定將為人體內(nèi)輪狀病毒感染的免疫保護(hù)機(jī)制研究提供新思路與新手段，同時也可為輪狀病毒疫苗研制及評估提供新的侯選靶標(biāo)。 人源輪狀病毒的小型豬腹瀉模型建立方面。首先，我們用ELISA與RT-PCR相結(jié)合鑒定了重慶地區(qū)20

15、04年12月至2005年3月期間腹瀉兒童的糞便標(biāo)本25例，其中G1血清型22例，G3血清型3例。然后我們用野生型人源輪狀病毒G1與G3血清型口服接種不同日齡的小型豬。結(jié)果表明，3-5日齡小型豬均出現(xiàn)了典型的臨床腹瀉癥狀；糞便中輪狀病毒抗原排泄可平均持續(xù)5-7天；小腸組織可見明顯的病理變化，同時用免疫熒光檢測方法可在小腸組織中檢測到特異性輪狀病毒抗原；透射電鏡進(jìn)行觀察，在小腸組織的超薄切片中可見到大量的輪狀病毒顆粒。30-35日齡小型豬可

16、出現(xiàn)明顯腹瀉臨床癥狀，糞便中輪狀病毒抗原排泄可持續(xù)4-7天；56-60日齡小型豬接種野生型人源輪狀病毒G1血清型后，均未出現(xiàn)典型的腹瀉癥狀，但可持續(xù)排毒2-3天。上述實驗結(jié)果表明，小型豬可作為人源輪狀病毒感染的理想腹瀉模型。 最后，我們用胞內(nèi)因子IFN-γ染色的方法，初步檢測小型豬人源輪狀病毒感染的腹瀉模型中外周血、脾、肝、肺部淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)及派氏淋巴結(jié)產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T細(xì)胞頻率。結(jié)果表明，3-5日齡小型豬各組織中