微囊化hES-293細(xì)胞生物學(xué)性狀檢測(cè)及其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：聚電解質(zhì)絡(luò)合法制作海藻酸鈉-殼聚糖-海澡酸鈉（ACA）微囊化人內(nèi)皮抑素/293（humanEndostatin/293，hES/293）細(xì)胞，檢測(cè)不同密度ACA微囊化hES/293細(xì)胞體外培養(yǎng)狀況下的生物學(xué)性狀，及其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的作用；比較微囊前后hES/293細(xì)胞生物學(xué)性狀差異。方法：聚電解質(zhì)絡(luò)合法制作不同密度的ACA微囊化hES/293細(xì)胞，分為3組：A組低密度組，為1×104cells/ml組；B組中密度

2、組，為1×106cells/ml組；C組高密度組，為1×108cells/ml組，每組6個(gè)樣本，分別在實(shí)驗(yàn)觀察的第1、3、7、14、35天，采用倒置顯微鏡觀察、臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)不同密度微囊化細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)和存活率，MTT法測(cè)定微囊化hES/293細(xì)胞及微囊化hES/293細(xì)胞與HUVEC共培養(yǎng)后HUVEC生長(zhǎng)狀況、ELISA法檢測(cè)上清液中目的蛋白的含量；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)微囊前后hES/293細(xì)胞細(xì)胞周期。結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)觀察的35天內(nèi)，聚電解質(zhì)

3、絡(luò)合法制作的三種不同密度的ACA微囊化hES/293細(xì)胞，囊壁透明球形，表面光滑，直徑為500-700μm。1-3天內(nèi)，細(xì)胞以單細(xì)胞形式均勻分布于囊內(nèi)空間。7天以后，細(xì)胞逐漸聚集生長(zhǎng)為大小不等的細(xì)胞團(tuán)。三組微囊囊內(nèi)細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞數(shù)均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增多，囊內(nèi)細(xì)胞存活率均于第3天達(dá)最高，此后B組細(xì)胞存活率高于A、C組。三組細(xì)胞生長(zhǎng)速率均于第7天達(dá)高峰，此后B組細(xì)胞存活率基本保持穩(wěn)定，而A、C兩組持續(xù)降低，并于第35天降至最低點(diǎn)。ELISA法

4、檢測(cè)三組微包囊上清液目的蛋白含量發(fā)現(xiàn)，B、C組第7天釋放ES蛋白量達(dá)最高，分別為217.63±27.96ng/mL，179.74±10.64ng/mL；B組第7天以后趨于穩(wěn)定，直至第35天；A組在第14天分泌ES蛋白量達(dá)最高，為175.37±26.23ng/mL，以后顯著下降，第35天降至最低。三組ACA微囊化hES/293細(xì)胞與HUECV細(xì)胞共培養(yǎng)，第24小時(shí)，三組微囊化細(xì)胞對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖均未表現(xiàn)抑制作用，三組OD值分別與空白

5、組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.536，0.620，0.151，0.901，0.397，0.334）：第72小時(shí)，三組OD值均較空白組低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.000，0.000，0.000），其中，A組低于B、C兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.022，p=0.006）；第120小時(shí)，三組OD值均較空白組低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.000，0.000，0.000），其中，B組低于A、C兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.04

6、0，p=0.002）。MTT法對(duì)一周內(nèi)微囊化與非微囊化hES/293細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，微囊化細(xì)胞在前3天生長(zhǎng)緩慢，第5天以后生長(zhǎng)速率基本上與非微囊化細(xì)胞相當(dāng)。兩組在1、3、5、7天的OD值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t1=0.267，p1=0.795；t3=1.923，p3=0.083；t5=-1.363，p5=0.203；t7=1.424，p7=0.185）；流式細(xì)胞術(shù)分析微囊化與非微囊化hES/293細(xì)胞的S期比例發(fā)現(xiàn)，第1天和第3天，兩組細(xì)胞S期的

7、百分含量差別不大（t1=1.061，p1=0.443；t3=0.676，p3=0.551）；培養(yǎng)至第7天時(shí)，微囊化細(xì)胞S期的百分含量高于非微囊化細(xì)胞，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.725，p=0.034）；第14天微囊化細(xì)胞S期的百分含量仍然高于非微囊細(xì)胞（t=2.545，p=0.044）。結(jié)論：1.不同密度hES/293細(xì)胞制作ACA微囊可以影響hES/293細(xì)胞存活率，其中1X106cells/ml密度制作的微囊，囊內(nèi)細(xì)胞存活率較高，生