Am80誘導KLF5脫乙酰化和抑制血管平滑肌細胞增殖的機制研究.pdf

1、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的增殖和分化受一系列調(diào)節(jié)因子構(gòu)成的信號網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控。其中轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子5(krüppel-like factor5,KLF5)通過調(diào)節(jié)增殖/分化基因的表達活性而影響細胞的增殖活性。有研究顯示,人工合成的維甲酸衍生物Am80通過激活其受體RARα而抑制KLF5與RARα相互作用和KLF5的活化,進而解除KLF5對p21基因表達的抑制。然而,Am

2、80是通過何種機制抑制KLF5活性尚不清楚。乙?；揎椩贙LF5活性調(diào)節(jié)中具有重要意義,但對其在VSMC分化中的作用研究較少。本研究以組蛋白脫乙酰酶(histonedeacetylases,HDACs)為切入點,以p21為靶基因,探討KLF5乙?；礁淖兣c其轉(zhuǎn)錄激活活性的關(guān)系,并揭示其作用機制。
　　 方法與結(jié)果:
　　 1 Am80抑制VSMC細胞周期的進程
　　 用流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布,結(jié)果顯示,與對

3、照組相比Am80刺激VSMC24h后,G0/G1期細胞所占比例上升了13％,S期細胞比例下降了29％。兩組之間具有顯著性差異。說明Am80可誘導細胞周期阻滯。
　　 2 Am80抑制VSMC增殖
　　 MTT分析結(jié)果顯示,Am80刺激細胞12、24、48 h,VSMC增殖活性顯著被抑制。與對照組相比,細胞增殖活性分別降低了44％、35％、26％,該結(jié)果與細胞周期分析數(shù)據(jù)具有一致性。
　　 3 Am80誘導p21蛋

4、白的表達
　　 為了探討Am80誘導細胞阻滯的作用機制,我們選用不同濃度Am80刺激細胞24h,提取總蛋白,觀察細胞周期抑制蛋白p21表達的變化,Western blot結(jié)果顯示,在Am80濃度為0-5μM范圍內(nèi),隨著Am80濃度增加,p21的表達水平呈劑量依賴性的升高,提示Am80可上調(diào)p21蛋白表達。4 Am80顯著抑制球囊損傷誘導的血管內(nèi)膜增生
　　 與假手術(shù)組相比,球囊內(nèi)皮剝脫后14天的模型組頸總動脈中膜內(nèi)的VS

5、MC排列紊亂,內(nèi)膜呈彌散性增厚,管腔變小,內(nèi)膜與中膜的厚度比值(I/M)(2.10±0.26)明顯高于假手術(shù)組(0.18±0.08);Am80組新生內(nèi)膜的增生程度和I/M比值(0.3±0.11)明顯小于模型組(P＜0.05,n=3)。結(jié)果表明,Am80可以明顯抑制球囊損傷誘導的血管內(nèi)膜增生。
　　 5 Am80通過抑制KLF5乙酰化上調(diào)p21表達
　　 為探討Am80抑制p21表達的分子機制以及KLF5乙?；阶兓欠?/p>

6、在該過程中發(fā)揮作用,進行觀察了Am80對KLF5乙?；挠绊憽Ｓ貌煌瑵舛華m80(0、1、2、5和10μM)處理VSMC2h,提取細胞總蛋白,經(jīng)抗KLF5抗體免疫沉淀后,用抗賴氨酸抗體進行Western印跡分析,以檢測KLF5的乙酰化水平。結(jié)果顯示,隨著Am80濃度的增加,KLF5乙酰化水平逐漸降低,具有明顯的劑量依賴關(guān)系。
　　 整體動物實驗也證明,與模型組相比,給予Am80的大鼠血管組織中,KLF5乙酰化水平降低。在術(shù)后3d

7、和14d時,Am80組血管乙?；疜LF5水平分別較模型組下降了17％和34％。上述結(jié)果在整體水平及細胞水平證實,Am80能抑制KLF5的乙?；健?br>　　 6 Am80誘導KLF5與HDAC2相互作用
　　 HDAC2是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)乙?；揎椀年P(guān)鍵酶。為確定HDAC2是否參與Am80誘導的KLF5脫乙?；^程,本研究觀察了KLF5與HDAC2的相互作用。免疫共沉淀分析結(jié)果顯示,在Am80刺激前后的VSMC中,KLF5均可與

8、HDAC2共沉淀;但是Am80刺激后,KLF5和HDAC2相互作用程度呈劑量依賴性增強,說明Am80能顯著促進二者結(jié)合。免疫雙熒光共定位分析結(jié)果進一步證實,在VSMC中KLF5與HDAC2共定位,疊加后的熒光強度隨著Am80刺激而增強。給予RARα受體抑制劑Ro41-5253預處理VSMC,可消除Am80誘導的KLF5與HDAC2相互作用。上述結(jié)果表明Am80誘導KLF5脫乙?；c促進KLF5與HDAC2的相互作用有關(guān)。
　　

9、7乙酰化的KLF5促進p21啟動子活性
　　 為了確定KLF5是否參與調(diào)節(jié)p21啟動子活性以及與HDAC2相互作用對其轉(zhuǎn)錄激活作用的影響,分別將p21啟動子指導的報告基因質(zhì)粒(p21-luc)與KLF5和/或HDAC2表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細胞,通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)定量分析啟動子的活性。結(jié)果顯示,293A細胞共轉(zhuǎn)染HDAC2和KLF5后,所測得熒光素酶的活性比單獨轉(zhuǎn)染KLF5升高了3倍。提示,KLF5與HDAC2對p2

10、1基因啟動子的激活具有協(xié)同效應。為了確定該協(xié)同效應是否與KLF5的乙?；嘘P(guān),進而構(gòu)建KLF5乙酰化位點突變(K369R)的表達質(zhì)粒,并分別將其與乙?；竝300表達質(zhì)粒和p21-luc共轉(zhuǎn)染293A細胞,觀察對報告基因活性的影響。結(jié)果顯示,p300和KLF5表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞時,可協(xié)同抑制報告基因的表達活性。當KLF5突變體與P300表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時,對p21啟動子的協(xié)同抑制作用消失。上述結(jié)果表明:KLF5的乙?；种苝21的表達;K